Прескочи към главното съдържание на страницата

Архив


БРОЙ 1 2007

Антисенс лекарствената терапия - нов подход при лечение на дислипидемиите

виж като PDF
Текст A
д-р И. Даскалов, доц. д-р Д. Гочев



РЕЗЮМЕ  
Представяме един нов подход за лечение на пациенти с дислипидемия, наречен антисенс лекарствена терапия. Методът включва приложение на медикаменти, които специфично и избирателно блокират синтеза на ароВ-100 на клетъчно ниво. Известен е фактът, че използваните на настоящия етап антидислипидемични медикаменти имат минимално влияние към този изключително важен параметър на липидния метаболизъм. Разгледани са някои клинични аспекти на аро-В, проведените до момента клинични проучвания, доказващи ползите от прилагането на антисенс терапията, както и някои бъдещи насоки за развитие.  
 
Ключови думи: антисенс лекарствена терапия, аро-В, ДНК, РНК, транскрипция, транслация, рибозоми.  
 
 
Липопротеинов метаболизъм.  
Триглицеридите и холестеролът се транспортират чрез хиломикрони и хиломикронни остатъци от чревния тракт към черния дроб и чрез VLDL и LDL от черния дроб към периферните тъкани. Ендогенният път на липидния метаболизъм започва със синтеза в черния дроб на VLDL-частици, съдържащи ароВ-100 и ароЕ. АроB-100 е структурен протеин, необходим за синтезата и секрецията за VLDL, IDL, LDL, Lp(a) и е есенциален свързващ протеин (лиганд) на LDL-рецептора. АроB-48 (съдържа 48% от ароB-100) е необходим за синтезата и секрецията на хиломикрони и не е лиганд на LDL-рецептора. Синтезата и секрецията на ароВ съдържащите липопротеини в черния дроб и червата е зависимо от микрозомалния триглицерид трансфериращ протеин, който пренася липиди към ароВ. Холестеролови естери и други аполипопротеини се добяват, за да се формират зрели VLDL-частици. Липолитичното действие на липопротеин липазата, (за която ароС-II е първичен лиганд) преобразува VLDL в по-малки VLDL-частици (остатъци), обогатени на ароВ-100 и ароЕ. Остатъците се изчистват от плазмата или чрез LDL-рецептора (или рецептора за отломки) или чрез хидролиза от хепатоцитната триглицеридлипаза до LDL-частици, съдържащи ароВ-100. АроА-1 се синтезира от черния дроб и след взаимодействие с АТФ-свързания касетъчен транспортер 1 (АВСА-1) се секретира в плазмата като бедна на липиди АроА-1-частица. При обратния холестеролов транспорт ново-синтезираните бедни на липиди АроА-1 взаимодействат с периферно-клетъчния АВСА-1, отсранявайки ексцесивните клетъчни натрупвания от холестерол, превръщайки с в пре-бета HDL. Пре-бета HDL се конвертират в зрели HDL чрез ензима лецитин-холестерол-ацил- трансфераза (LCAT-черна стрелка). HDL-холестеролът се връща в черния дроб по два пътя: селективно поемане на холестерола чрез хепатоцитния SR-B1 (scavenger receptor-клас В, тип 1) или чрез трансфер на холестеролови естери чрез CETP (холестеролови естери трансфериращ протеин) към VLDL-LDL с поемане в хепатоцита чрез LDL-рецептора.  
 
 
Схема, отразяваща основните етапи на липопротеиновия метаболизъм (подробности виж в текста)  
 
Ключовото значение на ароВ-100 в липопротеиновия метаболизъм, респективно патология, се демонстрира от два примера на фамилно асоциирани дислипидемии.  
Фамилна дефектна синтеза на ароВ-100 е автозомно доминантно заболяване, което подобно на фамилната хиперхолестеролемия е асоциирано с нарушено свързване на LDL-частиците към LDL-рецептора. Тази болест се различава от фамилната хиперхолестеролемия по това, че дефектът е на самия apoB-100 лиганд на LDL-частицата, а не на LDL-рецептора. Последващият ефект е редуциран клирънс и повишени LDL-плазмени нива.  
Фамилна комбинирана хиперлипидемия е относително често срещано автозомно доминантно заболяване, причинено от хепатоцитна свръхпродукция на apoB-100, респективно ароВ-100 зависими липопротеини.  
 
 
Диаграма, демонстрираща относителния дял на липидните нарушения при мъже с преждевременна ИБС  
Само 12,5% от пациентите са с нормален липиден статус, 10% с хипер ароВ и около 70% с патологични серумни нива на ароВ-100 съдържащите липопротеини.  
 
 
Антисенс технологията е нов терапевтичен метод, чрез който се блокира производството на патологичен протеин на интрацелуларно ниво. Белтъците са основни компоненти на всяка жива клетка/ензими, хормони, антитела и др. Свръхпродукцията или абнормно синтезираните протеини са свързани с много и различни по характер заболявания. Гените съдържат необходимата информация за синтеза на белтъци и са образувани от азотни бази (Аденин, Тимин, Цитозин и Гуанин). Те са свързани последователно, за да формират две нишковидни структури, приличащи на усукана стълба известна като ДНК. Нуклеотидите от едната ДНК-верига адхерират с комплементарни нуклеотиди от другата на основата на правилото: аденин с тимин (А-Т) и цитозин с гуанин (Ц-Г). Това специфично свързване е известно като хибридизация, а последователността на нуклеотидите е доказателствена за производството на даден протеин. Едната от ДНК веригите се нарича чувствителна (sens strend), а другата - нечувствителна (antisens strend). Продукцията на белтък се осъществява в две последователни фази: транскрипция и транслация. В транскрипционната фаза ДНК sense веригата се използва като модел за синтез на мРНК (съобщителна или матрична, messengerRNA), в чиято верига нуклеотидът Урацил се използва вместо тимин. В транслационната фаза мРНК осъществява преноса на генетична информация от ядрото на клетка в цитоплазмата и по-конкретно в рибозомите, където се осъществява синтезът на протеини.  

Основи на антисенс технологията:  
 
 

Антисенс технологията се основава на принципа да бъде медикаментозно блокирана транслационната фаза от белтъчната продукция, използвайки методи, които не позволяват на мРНК да достигне до рибозомите. Антисенс препаратите са къси, химически модифицирани вериги, които се свързват със специфични зони от комплементарни участъци на мРНК. Там, където медикамента се свърже настъпва деградация на комплекса лекарство-мРНК чрез собствения за клетката ензим РНКаза (рибонуклеаза). До този момент са създадени две поколения антисенс медикаменти.  
  
При второто поколение във връзка с променената химична структура се съобщава за подобрена специфичност и увеличена резистентност към ензимна деградация. Ниският клирънс на лекарството от плазмата позволява по-свободен дозови режим и възможности за орално приложение.  
 
Клинични проучвания за ползата от приложението на втора генерация антисенс лекарства за редукция на ароВ, общ холесторол и фракции при пациенти със ССС:  
Фармацевтичната компания Isis Pharmaceuticals съобщава данни от завършила фаза I на клинично проучванe, проведено при здрави доброволци, при които е било предварително известно липидно нарушение с увеличен холестерол. Използван е антисенс втора генерация медикамент - ISIS 301012, при което е било демонстрирано бързо и продължително, дозо-зависимо понижение на ароВ-100, LDL, VLDL и общия холестерол, като резултатите са представени на IХ-я Световен конгрес по лекарствени технологии в Бостън. Данните от това проучване са първите, доказващи специфична инхибиция на ароВ-100 синтеза с допълнителна редукция на общия холестерол и субфракциите. Както е известно, ароВ-100 е независим рисков фактор за сърдечно-съдова болестност и смъртност, без особени терапевтични възможности с известните до момента медикаменти. Антисенс предлага принципно различен терапевтичен подход в сравнение с използваните към настоящия момент липидо-понижаващи средства. Целта на това начално плацебо контролирано, доза-ескалиращо проучване е било да се установи безопасността и фармакокинетичният профил на ISIS 301012, както и способността да редуцира наличното липидно нарушение. Рандомизирани са били 40 участници със серумен холестерол в границите от 200 до 300 mg/dl. Серумните нива са изследвани преди рандомизацията. Разпределени са били в четири дозови кохорти от 50, 100, 200 и 400 mg. Медикаментът се е прилагал само паренерално, като след начална доза за определяне на безопасност се е преминало към натоварващ режим на трикратно приложение, последван от единична доза седмично за период от три седмици.  
 
 
Предварителни резултати, отчетени на 25 ден (Табл. 1):

  1.    LDL редукция в границите от 27%/100 mg до 44%/400 mg.  
  2.    VLDL редукция в границите от 14%/100 mg до 38%/400 mg.  
  3.    Редукция на общия холестерол в границите от 7%/100 mg до 36%/400/mg.  
  4.    В допълнение е отчетена и анализирана редукция на ароВ-100 с повече от 55% и при трите режима (100, 200 и 400 mg) като началото на действие е било бързо в границите на първата седмица, като ефекът се е запазил за продължителен период от време - за повече от три месеца.

 
 
 
 
 
Окончателни резултати от проучването (Табл. 2):

  1.    Средна редукция на ApoB-100 от 30% (50mg) до 52% (400mg). Ефектът от 200 mg ISIS 301012, отбелязан на 39-я ден (14 дни след последната доза) на ApoB-100, се е различавал от плацебо с P=0.006.  
  2.    Средна редукция на LDL от 17% (50 mg) до 48% (400 mg). Ефектът от 200 mg ISIS 301012, отбелязан на 39-я ден, различавал LDL от плацебо с P=0.002.  
  3.    Средната редукция на общия холестерол от 16% (50 mg) до 40% (400 mg). Ефектът от 200 mg ISIS 301012, отбелязан на 39-я ден, различавал тоталния холестерол от плацебо с P=0.0006.  
     
     
     
     
  4.    Ефектът в групата със 100 mg е бил също статистически сигнификантен.  
  5.    Минималната ефективна доза е била 50 mg седмично.  
  6.    Началото на действие е било бързо, незабавно след натоварващия режим.  
  7.    Медикаментът увеличава серумните концентрации на НDL и нормализира съотношението LDL/HDL.  
  8.    В групата с плацебо не са регистрирани положителни промени в липидния профил.  
  9.    Не са докладвани сериозни странични ефекти. Най-често съобщавания нежелан ефект е кожна реакция на мястото на подкожно инжектиране, която изследователите не свързват с продължителността на апликация. Възможно е леко степенно увеличение на чернодробните трансаминази, което корелира със степенното понижение на серумния холестерол и в никакъв случай не надминава наблюдаваното при другите липидо-понижаващи медикаменти.

 
 
Изводи и бъдещи насоки:  
Понижаването нивата на липидите е основен компонент в терапевтичната стратегия на сърдечно-съдовите болести. АроB-100 е структурен протеин, необходим за синтезата и секрецията за VLDL, IDL, LDL, и Lp(a) и е есенциален свързващ протеин (лиганд) на LDL-рецептора. Той е подходяща молекулна мишена за антисенс лекарствената технология.  
Фаза II на клинични проучвания с антисенс е планирана за втората половина на 2005 г., като целите са да се оптимизира дозовия режим, да се определят взаймодействието с други липидо-понижаващи медикаменти (статини) и ефектът от комбинираната терапия, приложението на медикамента при някои генетични заболявания с тежкостепенни липидни нарушения (фамилна хиперхолестеролемия).  
 
 
 
КНИГОПИС:

1. Dean, N.M. Functional genomics and target validation approaches using antisense oligonucleotides technology. Curr Opin Biotechnol. 12(6):622-5, 2001.  
2. Geary, R.S., Yu, R.Z., Levin, A.A. Pharmacokinetics of phosphorothioate antisense oligodeoxynucleotides. Curr Opin Investig Drugs. 2(4):562-573, 2001.  
3. Crooke, S.T. Progress in antisense technology: The end of the beginning. Methods Enzymol. 313(Antisense Technology, Part A):3-45, 2000.  
4. Crooke, S.T. Antisense Therapeutics. Biotechnology and Genetic Engineering Reviews. 15; 121-157, 1998.  
5. Vickers, T.A., Koo, S., Bennett, C.F., Crooke, S.T., Dean, N.M., Baker, B.F. Efficient reduction of target RNAs by small interfering RNA and RNase H-dependent antisense agents. A comparative analysis. J Biol. Chem. 278(9):7108-18, 2003.  
6. Sazani, P., Gemignani, F., Kang, S-H, Maier, M.A., Manoharan, M. Persmark, M., Bortner, D., and Kole, R. Systematically delivered antisense oligomers upregulate gene expression in mouse tissues. Nat. Biotechnol. 20: 1228-1233, 2002.  
7. Crooke, S.T. Molecular mechanisms of action of antisense drugs. Biochim Biophys Aca.1489 (1): 31-43, 1999.  
8. Wu, H., Lima, W.F. and Crooke, S.T. Properties of cloned and expressed human RNase H. J. Biol. Chem. 274(40)28270-28278, 1999.  
9. Waring, J.F., Ciurlionis, R., Clampit, J.E., Morgan, S., Gum, R.J., Jolly, R.A., Kroeger, P., Frost, L., Trevillyan, J., Zinker, B.A., Jirousek, M., Ulrich, R.G., Rondinone, C.M. PTP1B antisense-treated mice show regulation of genes involved in lipogenesis in liver and fat. Molecular and Cellular Endocrinology. 203: 155-168, 2003.  
10. Levin, A., Henry, S., Monteith, D., and Templin, M. Toxicity of antisense oligonucleotides. In: Antisense Drug Technology: Principles, Strategies, and Applications (ed. Crooke, S.T.), pp. 201-267. Marcel Dekker, Inc., New York, 2001.  
11. Dorr, A., Glover, J., and Kwoh, J. Clinical safety of phosphorothioate oligodeoxynucleotides. In: Antisense Drug Technology: Principles, Strategies, and Applications (ed. Crooke, S.T.), pp. 269-290. Marcel Dekker, Inc., New York, 2001.