Прескочи към главното съдържание на страницата

Архив


БРОЙ 10 2008

Флоуцитометрично изследване на тромбоцити при пациенти с имунна тромбоцитопенична пурпура

виж като PDF
Текст A
Д-р Цветан Христофоров Луканов, д., д-р Ваня Славчева, д-р Галина Велева, доц. д-р Анжелика Велкова, д., доц. д-р Николай Цветков, д., доц. д-р Емилияна Конова, д.



Тромбоцитната функция обикновено е нормална или увеличена при пациенти с имунна тромбоцитопенична пурпура. Предполага се, че циркулиращите тромбоцити при такива болни имат увеличена хемостатична активност. С флоуцитометрична техника може да се измери експресията на тромбоцитни активационни рецепторни молекули, като нивото им е показател за степен на активност на тромбоцитите.  
 
Цел  
Цел на проучването е с приложението на моноклонални антитела и флоуцитометрична техника да се определи наличието на активирани циркулиращи тромбоцити при пациенти с имунна тромбоцитопенична пурпура, чрез измерване на повърхностната експресия на тромбоцитни гликопротеини.  
 
Материали и методи  
Извърши се флоуцитометрично изследване на цяла кръв от 30 пациенти с остра имунна тромбоцитопенична пурпура и 40 клинично здрави лица. Чрез директно двуцветно имунофлуоресцентно оцветяване се измери процентната и/или флуоресцентна експресия на тромбоцитните гликопротеини CD61, CD41а, CD62P, CD63 и CD154.  
 
Резултати  
Сигнификантно повишена процентна и флуоресцентна експресия (р<0.05) регистрирахме при болните с имунна тромбоцитопенична пурпура спрямо контролите за всички маркери - CD62P, CD63, CD154. Статистически понижена флуоресцентна експресия установихме на тромбоцитно специфичните CD61 (при осем от болните - pz=0.001) и CD41а (при пет от болните - pz=0.001). Регистрирахме значима обратна корелация на процентната и флуоресцентна експресия на CD62p, CD63 и CD154 спрямо тромбоцитния брой.  
 
Заключение  
Установихме безспорни доказателства за наличие на циркулираща активирана субпопулация от тромбоцити при болните с имунна тромбоцитопенична пурпура. Специфичният флоуцитометричен анализ на гликопротеиновата експресия може да помогне за идентифициране на специфични антитромбоцитни антитела.  
Ключови думи: флоуцитометрия, имунна тромбоцитопенична пурпура, CD61, CD41а, CD62P, CD63, CD154.  
 
 
Имунната (идиопатична) тромбоцитопенична пурпура (ИТП) е автоимунно заболяване, което се характеризира с понижен брой на тромбоцити (Тр) в кръвта и нормален до увеличен брой на мегакариоцити в костния мозък[1]. ИТП се причинява от антитромбоцитни автоантитела (аТрАт), които се свързват чрез своя Fab фрагмент към различни тромбоцитни антигени и подпомагат фагоцитозата на Тр[2]. Патогенетичните аТрАт най-често са насочени срещу гликопротеините (GP) IIb/IIIa и Ib/IX[3].  
 
Тромбоцитната функция обикновено е нормална или увеличена при пациенти с ИТП, като често времето на кървене е по-кратко от очакваното за степента на тромбоцитопенията[4]. При някои пациенти обаче, се установява нарушена тромбоцитна функция. Антитела срещу GP IIb/IIIa (CD41/CD61) и GP Ib/IX могат да причинят функционално тромбоцитно заболяване, неразличимо от тромбастения на Glanzmann и синдрома на Bernard-Soulier[1,4]. Описани са нарушения в агрегацията или подтисната тромбоцитна адхезия към субендотелния матрикс под действието на аТрАт[1]. От друга страна, свързването на автоантителата към някои гликопротеини, например GP VI, GP IV или CD9, може да е причина за патологично активиране или деструкция на Тр[4,5].  
 
Важно е да отбележим по-лекото клинично протичане на ИТП, дори при по-нисък тромбоцитен брой, в сравнение с други тромбоцитопении[1,3]. Това обстоятелство предполага, че циркулиращите Тр при ИТП имат увеличена хемостатична активност[4]. От друга страна, някои автори са на мнение, че е спорно твърдението относно повишения активационен статус на циркулиращите Тр при пациентите с ИТП[5]. Тези съмнения произтичат от установената специфичност на аТрАт срещу един или повече от рецепторите: GP IIb/IIIa, GP Ib/IX, GP VI, GP Ia/IIb, GP IV, CD9[6]. Очевидно съществуват редица въпросителни по отношение на наличието на циркулиращи активирани Тр, участващи в поддържането на относително благоприятна хемостатична активност при ИТП.  
 
Стандартните методи за определяне на тромбоцитна активация като агрегометрия, измерване на плазмен β-тромбоглобулин и други, изискват допълнителни манипулации in vitro. С тях се установят само средните данни на цялата тромбоцитна популация, но не е възможно да се анализират отделните субпопулации на Тр. Прилагането на флоуцитометрични методи компенсира тези недостатъци. При активиране, Тр претърпяват специфични промени, които могат да бъдат идентифицирани чрез прилагането на флуоресцентно оцветени моноклонални антитела (MoAт) и флоуцитометрична техника. Така например, активирането на Тр индуцира транслокация на гликопротеините CD62P и CD63 от гранулите до клетъчната мембрана. Нивото на експресия на тези рецепторни молекули лесно може да се определи флоуцитометрично и е показател за степента на активност на Тр.  
 
P-селектин или CD62P съществува под две форми - мембранна и разтворима, като и двете притежават свързваща активност по отношение на лигандите. Мембранният P-селектин е локализиран в телцата на Weibel-Palade на ендотелните клетки (ЕК) и в α-гранулите на Тр. CD62P е активационно-зависим рецептор, което означава, че не се експресира от клетъчната мембрана на „почиващи” клетки[7]. При активиране и дегранулиране на Тр, P-селектинът се транслокира и експресира на плазматичната мембрана като функционално активна адхезионна молекула. CD62P подпомага адхезията на левкоцитите към ЕК и е отговорен за адхезията на активираните Тр към други клетки като ЕК, моноцити и гранулоцити.  
 
CD63 e лизозомен, мембранен, активационно-зависим тромбоцитен антиген. Принадлежи към фамилията на tetraspanin-протеините. Характерно за членовете на това семейство е, че функционират чрез формиране на комплекси помежду си, с други клетъчно-повърхностни протеини или с интегрините. Има съобщение, че след активиране на Тр и експресиране на клетъчната им мембрана, CD63 формира комплекс с CD9 и интегрина GPIIb/IIIa, като модулира и засилва неговата активност[8]. Точното функционално значение на CD63 все още не е установено. Предполага се неговата роля като протектор на мембраните на лизозомите или като адхезивен рецептор. Независимо от неуточнената функция, CD63 е удобен маркер за флоуцитометрично изследване на активационното състояние на Тр, тъй като не се експресира когато са в неактивирано състояние.  
 
CD154 или CD40L e трансмембранен протеин, структурно сходен с TNF. Той е лиганд на CD40. През последните години CD40L беше локализиран в Тр и се доказа, че секунди след тяхната активация се транслокира и експресира на клетъчната им мембрана. Повърхностно експресираният CD40L претърпява протеолитично разцепване и се отделя от тромбоцитната мембрана за период от минути до часове след активиране на Тр, с последващо генериране на разтворими фрагменти (разтворим CD40L или sCD40L)[7,9]. Взаимодействието CD40-CD40L засилва възпалителните процеси и тромботичния отговор чрез стимулиране на активацията на Тр и формирането на хомотипни агрегати[7,10].  
 
Цел на проучването е с приложението на МоАт и флоуцитометрична техника да се определи тромбоцитният активационен статус при пациенти с ИТП, чрез изследване на експресията на тромбоцитните гликопротеини CD62P, CD63 и CD154.  
 
Материали и методи  
 
Пациенти
 
След информирано съгласие беше извършено флоуцитометрично изследване на 30 нелекувани пациенти с диагноза остра имунна тромбоцитопенична пурпура на средна възраст 40.43±12.22 години. От тях - 11 мъже и 19 жени. Диагнозата беше поставена съобразно Алгоритъм на Американското дружество по хематология[11].  
Като контролна група бяха изследвани (след информирано съгласие) 40 клинично здрави лица на средна възраст 37.10±10.64 години, разпределени по пол: жени - 20; мъже - 20.  
Изследването беше проведено в МДЛ по Имунология при УМБАЛ – гр. Плевен.  
 
Методи  
За изследването беше използвана свежа, цитратна, венозна кръв в количество 4.5 ml, взета без турникет. Кръвните проби бяха обработени съгласно методичните указания на фирмата Becton Dikcinson (BD), USA, която е производител на използваните МоАт[12]. Бяха спазени изискванията на водещи автори за минимални манипулации при обработка на пробите с цел предпазване от in vitro активиране и агрегиране на Тр и потенциална загуба на тромбоцитни субпопулации[13]. Беше приложено директно двуцветно имунофлуоресцентно оцветяване и комбинация от тромбоцитно-специфични МоАт (CD61 или CD41а) и тромбоцитно-асоциирани, активационно-зависими МоАт (CD62P, CD63, CD154).  
 
Приемането на 5 000 до 10 000 Тр положителни за приложените тромбоцитно-специфични МоАт беше извършено на флоуцитометър FACSort, BD, с аргонов лазер. По време на приемането на пробите и анализът на резултатите, тромбоцитният регион беше очертан на точкова графика по CD61 (странично разсейване или CD41а) странично разсейване. Анализът на резултатите беше извършен с компютърен софтуер CellQuest. Резултатите бяха представени като процент положителни Тр, които експресират изследвания маркер и техния среден флуоресциращ интензитет или средна повърхностна антигенна експресия (MFI). Резултатите от CD61 и CD41а бяха представени само като MFI, тъй като се експресират от всички Тр.  
 
Статистически методи  
За определяне на статистическа достоверност при сравняване на количествени променливи с еднакви дисперсии и нормално разпределение на данните е използван параметричен t-тест на Student-Fisher. За определяне на статистическа достоверност при сравняване на количествени променливи при независими извадки с малък брой случаи и разпределения, различни от нормалното, е приложен непараметричен метод – U-тест на Mann-Whitnеу. За изследване на взаимовръзки между количествени променливи – корелационен анализ с оценка (р) на коефициента на корелация (r). Всички връзки, зависимости и разлики между изследваните групи са установени при сигнификантно ниво на значимост на нулевата хипотеза – р<0.05.  
 
Резултати  
След сравняване на средноаритметичната стойност със стандартно отклонение (X±SD), не установихме статистическа разлика (р>0.05) на MFI-експресията на активационно независимите тромбоцитни гликопротеини CD61 (23.08±2.11) и CD41a (25.3±1.3) при пациентите с ИТП, спрямо контролната група - съответно CD61 (23.1±1.1) и CD41a (25.56±1.08). Анализирахме индивидуалните резултати на пациентите в групата с ИТП и констатирахме понижена MFI-експресия на CD61 при 8 (26.6%) болни и на CD41a при 5 (16.6%) от болните в групата. Медианата на осемте пациенти с понижена MFI-експресия на CD61 беше 20.8. След сравнение с медианата на останалите 22 болни с ИТП, съответно 24.7, установихме статистически достоверно понижена експресия при осемте болни (pz=0.001). Аналогично, медианата на петте пациенти с понижена MFI-експресия на CD41а беше 23.2. След сравнение с медианата на останалите 25 болни в групата с ИТП, съответно - 26.1, регистрирахме сигнификантно по-ниска MFI-експресия на CD41а при петте болни (pz=0.001).  
 
Получихме следните резултати, представени като X±SD за процентната експресия на тромбоцитните CD154 - 2.13±1.56, CD62p - 5.99±3.69 и CD63 - 5.92±1.51 в групата с ИТП. След сравнение с резултатите от контролите, съответно – CD154 (0.63±0.30), CD62p (2.18±0.51), CD63 (3.5±0.76), установихме статистически повишена процентна експресия и за трите маркера при пациентите с ИТП (p<0.05) (Фиг. 1).  
 
Сравнихме получените резултати на тромбоцитната MFI-експресия на маркерите CD154 (28.59±3.7), CD62p (41.81±4.1), CD63 (35.3±2.2) в групата с ИТП и контролната група (съответно 25.01±0.84, 36.57±0.65, 32.85±0.82). Установихме статистически повишена MFI-експресия на трите маркера (p<0.05) от Тр на пациентите с ИТП, спрямо здравите лица (Фиг. 2).  
 
С помощта на корелационен анализ установихме значима обратна зависимост на процентната експресия на CD154, CD62p, CD63, спрямо тромбоцитния брой, като корелационният коефициент достигна съответно: CD154 (r=-0.56; p=0.001), CD62p (r=-0.72; p=0.0001), CD63 (r=-0.58; p=0.001). Най-висока беше корелационната зависимост на процентната експресия на CD62р спрямо броя на Тр при болните с ИТП (Фиг. 3).  
 
Силна обратна зависимост констатирахме между броя на Тр и MFI-експресията на маркерите CD154 (r=-0.64; p=0.0003), CD62p (r=-0.62; p=0.0001), CD63 (r=-0.52; p=0.003).  
 
Обсъждане  
ИТП е автоимунно заболяване, при което опсонизираните с автоантитела Тр биват подложени на деструкция от ретикулоендотелната система. Патогенетичният механизъм се потвърждава и от факта, че блокирането на Fcγ-I-рецепторите (FcγRI) на фагоцитите чрез МоАт, намалява тяхната способност да разрушават IgG-свързаните Тр[14]. По-късно беше установено, че високо афинитетният фагоцитен FcγRI има по-малко значение за фагоцитозата на опсонизираните Тр, в сравнение с FcγRIIА[3]. Предполага се, че при наличие на аТрАт срещу GP Ibα, тромбоцитната деструкция настъпва по механизмите на директна цитотоксичност или комплементна фиксация, което би затруднило лечението, в частност с интравенозен имуноглобулин[3,15].  
 
При сравнение на резултатите от групата с ИТП и контролната група не установихме статистически променена MFI-експресия на маркерите CD61 и CD41a. Базирайки се на литературната справка за най-честа насоченост на аТрАт към CD61 и CD41a очаквахме да регистрираме сигнификантно изменение при някои от двата маркера в групата с ИТП. Обяснение на нашия резултат потърсихме в специфичността на аТрАт и прилаганите от нас МоАт спрямо различните гликопротеинови епитопи. Възможно е също, аТрАт да бъдат насочени към неоепитопи на мембранните гликопротеини, формирани в резултат на засилената тромбоцитна деструкция[1].  
 
Анализирайки резултатите на отделните пациенти в групата, констатирахме понижена, но не липсваща MFI-експресия на CD61 при 8 болни, спрямо останалите 22 пациенти в групата и на CD41a при 5 болни, спрямо останалите 25 пациенти в групата. Този наш резултат се подкрепя от съобщението на друг работен колектив[16] и може да се обясни с намалено свързване на приложените МоАт поради блокиране на антигенната им детерминанта върху гликопротеините CD61 и CD41a от налични аТрАт.  
 
Констатирахме сатистически повишена, процентна и MFI-експресия на маркерите за дегранулация CD62p и CD63 при пациентите с ИТП, спрямо контролите. Тези резултати са показателни за наличието на циркулираща активирана субпопулация от Тр при ИТП, която участва в поддържането на известна стабилност на съдовия интегритет, предвид понижения тромбоцитен брой. В подкрепа на нашите резултати е съобщението на друга авторска група[17].  
 
Установената обратна корелационна зависимост между броя на Тр и нивата на експресия на CD154, CD62p и CD63 при болните с ИТП показва, че е налице регулаторен баланс с оглед поддържане на благоприятна хемостаза. Факторите, които участват във формирането и персистирането на този баланс обаче, остават все още неизвестни.  
 
Друго доказателство за наличието на активирана субпопулация от Тр при болните с ИТП е установената статистически повишена процентна и MFI-експресия на CD154, спрямо контролите. А. Solanilla и съавт.[18], представят аналогични резултати, но установяват също, че тромбоцитно-асоциирания CD154 е способен да предизвика активиране на автореактивните В-лимфоцити, участващи в синтеза на аТрАт - формира се порочен кръг с участието на активираните Тр при ИТП. В този аспект е интересно съобщениeто на друга авторска група за добро клинично повлияване на пациенти с ИТП, след прилагане на хуманизирани анти-CD154 МоАт[19]. Съобщава се обаче, за индуциране на тромбоемболични усложнения след прилагане на анти-CD154 МоАт при хора и експериментални животни[19,20]. Известно е, че една от функциите на CD154 е стабилизиране на формирания тромб посредством GP IIIa-зависим механизъм[21]. Инхибирането на това взаимодействие с анти-CD154 МоАт може да направи тромбът нестабилен и способен да емболизира. Тези обстоятелства налагат необходимостта от периодично мониториране нивото на CD154 при използване на анти-CD154 МоАт, което може да се реализира успешно с флоуцитометричните методи.  
 
В заключение, регистрирахме безспорни доказателства за наличие на циркулираща активирана субпопулация от Тр при болните с ИТП. Констатираната тромбоцитна субпопулация няма патологично тромбоемболично действие, напротив, участва активно в поддържането на благоприятен хемостатичен баланс.  
 
Показахме индиректно, че специфичният флоуцитометричен анализ на гликопротеиновата експресия може да помогне за идентифициране на специфични антитромбоцитни антитела.  
 
КНИГОПИС:
 
 
1. George JN and Rizvi MA. Thrombocytopenia. In Williams Hematology, Ed. E. Beutler et al., McGraw-Hill Inc. New York. 2001:1495-1539.  
2. Semple JW, Aslam R, Kim M et al. Platelet-bound lipopolysaccharide enhances Fc receptor–mediated phagocytosis of IgG-opsonized platelets. Blood. 2007; 109,11:4803-4805.  
3. Beardsley DS. ITP in the 21st Century. Hematology. 2006; 1:402 - 407.  
4. Parise LV. Platelets in hemostasis and thrombosis., In: Wintrobe’s Clinical Hematology, Ed. G. Lee et al., Williams& Wilkins. Baltimore. 1999; 661-683.  
5. Boylan B, Chen H, Rathore V et al. Anti-GPVI-associated ITP: an acquired platelet disorder caused by autoantibody-mediated clearence of GPVI/FcRγ-chain complex from the human platelet surface. Blood. 2004;104:1350-1355.  
6. He R, Reid DM, Jones C et al. Spectrum of Ig classes, specifities, and titers of serum antiglycoproteins in chronic idiopathic thrombocytopenic purpura. Blood. 1994; 83:1024-1032.  
7. Hundelshausen P, Weber C. Platelets as immune cells: bridging inflammation and cardiovascular disease. Circ Res. 2007; 100:27-40.  
8. Israels SJ, McMillan-Ward E, Easton J et al. CD63 associates with the alphaIIb beta3 integrin-CD9 complex on the surface of activated platelets. Thromb Haemost. 2001; 85:134-141.  
9. Ferroni P, Santilli F, Guadagni F et al. Contribution of Platelet-Derived CD40 Ligand to Inflammation, Thrombosis and Neoangiogenesis. Curr Med Chem. 2007; 14,20:2170-80.  
10. Aukrust P, Muler F, Ueland T et al. Enhanced Levels of Soluble and Membrane-Bound CD40 Ligand in Patients With Unstable Angina. Circulation. 1999; 100:614-620.  
11. George JN, Woolf S, Rascob G et al. Idiopathic thrombocytopenic purpura: a practice guideline developed by explicit methods for the American Society of Hematology. Blood. 1996; 88:3-40.  
12. BD Biosciences Product Catalog. Immunocytometry Systems. Platelet activation, staining, and analysis. 2001; 215-222.  
13. Michelson AD. Flow cytometry: a clinical test of platelet function. Blood. 1996; 87:4925-4936.  
14. Ericson SG, Koleman KD, Wardwell K et al. Monoclonal antibody 197 (anti-Fc-γRI) infusion in a patient with immune thrombocytopenia purpura results in down-modulation of Fc-γRI on circulating monocytes. Br J Haematol. 1996; 92:718-724.  
15. Webster ML, Sayeh E, Crow M, Chen P, Nieswandt B, John Freedman J at al. Relative efficacy of intravenous immunoglobulin G in ameliorating thrombocytopenia induced by antiplatelet GPIIbIIIa versus GPIb antibodies. Blood. 2006; 108, 3:943-946.  
16. Yildirmak Y, Yanikkaya-Demirel G, Palanduz A, Kayaalp N. Antiplatelet antibodies and their correlation with clinical findings in childhood immune thrombocytopenic purpura. Acta Haematol. 2005; 113, 2:109-12.  
17. Hayashi S, Oshida M, Kiyokawa T et al. Determination of activated platelets: evaluation of methodology and application for patients with idiopathic thrombocytopenic purpura. Rinsho Byori. 2001; 49:1287-1292.  
18. Solanilla A, Pasquet J, Viallard J et al. Platelet-associated CD154 in immune thrombocytopenic purpura. Blood. 2005; 105:215-218.  
19. Kuwana M, Nomura S, Fujimura K et al. Effect of a single injection of humanized anti-CD154 monoclonal antibody on the platelet-specific autoimmune response in patients with immune thrombocytopenic purpura. Blood. 2004; 103:1229-1236.  
20. Kawai T, Andrews D, Colvin R et al. Thromboembolic complications after treatment with monoclonal antibody against CD40 ligand. Nat Med. 2000; 6:114-115.  
21. Andre P, Prasad K, Denis C et al. CD40L stabilizes arterial thrombi by a ß3 integrin–dependent mechanism. Nat Med. 2002; 8:247-252.
 
 
 
Легенда – Фигури  
 
 
Фиг. 1. Сравнение на процентната експресия на CD154, CD63 и CD62р от Тр на контролната група (n=40) и групата пациенти с ИТП (n=30) (*/**/*** - р<0.05).  
 
 
 
Фиг. 2. Сравнение на MFI-експресията на CD154, CD62р и CD63 от Тр на контролната група (n=40) и групата пациенти с ИТП (n=30) (*/**/*** - р<0.05).  
 
 
 
Фиг. 3. Корелация между процентната експресия на CD62р и броя на тромбоцитите (x109/L) при пациентите с ИТП (n=30).