Прескочи към главното съдържание на страницата

Архив


БРОЙ 11 2008

Специфична диагностика на хроничните вирусни хепатити

виж като PDF
Текст A
Доц. д-р П. Теохаров



Вирусният хепатит представлява инфекциозно заболяване, засягащо черния дроб на човека. Причинява се от пет вирусни агента, които са членове на различни вирусни семейства и са наречени според тропизма си хепатотропни вируси. Обозначени са с първите букви от латинската азбука, както следва: хепатит А вирус (HAV), хепатит В вирус (HBV), хепатит С вирус (HCV), хепатит D вирус (HDV) и хепатит Е вирус (HEV). От тях три вируса: хепатит В вирус (HBV), хепатит С вирус (HCV) и хепатит D вирус (HDV) причиняват хронична инфекция след острата фаза на заболяването.  
 
Диагностика на хепатит В вирусната инфекция  
От известните до сега имунохистохимични, молекулярни, имунно-ензимни (EIA) и др. методи за откриване на маркерите на HBV, най-широко приложение в диагностичната практика намира имунно-ензимният метод. Тестовете, който се базират на този метод, са стандартизирани, лесни за изпълнение с подходяща апаратура и са с достъпни цени. Маркерите на HBV, открити с тях са напълно достатъчни за поставяне на точната етиологична диагноза, като дори в случаите, когато е необходимо прилагането на молекулярни методи за откриването на вирусната нуклеинова киселина, тестирането на маркерите с диагностикуми, базирани на метода EIA, ги предхожда.  
 
Повърхностният антиген на HBV – HBsAg, е основен негов маркер и се намира в кръвта на почти всички случаи на инфекция с този вирус. Чувствителността на сега използваните тестове е под 0.5 ng/ml. Наличието дори на минимални количества HBsAg има диагностична стойност, така че се изисква максимална чувствителност на тестовете. Наличието на HBsAg, особено едновременно с HBeAg (неструктурен вирусен протеин)   , е белег на активна вирусна репликация. При по-ниски нива на вирусна репликация чувствителността на използваните молекулярни методи е от решаващо значение за откриването на HBV DNA.  
 
Сероконверсията на HBeAg към anti-HBe при острите хепатити, особено когато е съчетана с нормални чернодробни ензими, показващи цитолиза (ALT, AST), има най-често благоприятно прогностично значение, защото е последица на намалена вирусна репликация. Наличието на anti-HBe антитела при асимптоматични носители, също е маркер за благоприятно протичане на инфекцията и характеризира състоянието – неактивен HBV носител, когато е съчетано с ниска вирусна репликация.  
 
Откриването на anti-HBcIgG антителата се базира на метода EIA. Синтезът на тези антитела е реакция на имунната система, срещу HBcAg интегриран в клетъчната стена по време на инфекциозния процес. Наличието им съответства на минала или настояща инфекция с HBV, съобразно наличието или липсата на HBsAg, като основна тяхна характеристика е персистирането им за дълъг период от време. Те са маркер за установяване на разпространението на HBV инфекцията в човешката популация, като тяхното наличие предполага установяване на други маркери на HBV – HBsAg или anti-HBs.  
 
Диагностичните тестове откриващи anti-HBc IgM антителата от изследвания серум, се базират на метода EIA. Значението на тези антителата се определя от наличието им във високи титри при всяка остра инфекция с HBV, независимо от това дали е проявена или субклинична, като се откриват и при около 10-15% от пациентите с хронична форма на инфекцията.  
 
Най-използваният метод за откриване на anti-HBs в серума на изследваните лица е имунно-ензимният метод. Граничната стойност за определяне на положителен резултат е 10 mIU/ml, като за протективни се приемат стойности над посочената. Откриването на ДНК на HBV се базира главно на хибридизационни методи в различни модификации и на амплификационни техники, най-често полимеразна верижна реакция (PCR). Средната чувствителност на първите е около 103–104 gen.eql./ml, докато на PCR техниката достига до 10-100 gen.eql./ml. Автоматизирана модификация на PCR – Real Time PCR, също намира приложение.  
 
Наличието на HBV DNA е индикатор на вирусна репликация и съответстващата на това висока инфекциозност. С помощта на PCR се открива ДНК във всички HBsAg и HBeAg положителни пациенти, както и при повечето anti-HBe положителни. В някои случаи се открива ДНК и в серуми, отрицателни за HBsAg, но положителни за anti-HBc при т.нар. “окултни” хепатит В вирусни инфекции. Клиничното значение при откриването на HBV DNA чрез хибридизация или амплификационни техники е различно. Положителен резултат с хибридизация, означава значителна вирусна репликация и висока вероятност за активна чернодробна инфекция. Откриването на HBV DNA, заема важно място при проследяване ефекта от антивирусната терапия при хроничните хепатит В вирусни инфекции наред с тестирането на HBsAg.  
 
Табл. 1. Серологични маркери на HBV и тяхното значение  
 

 

HBsAg

Anti-HBs

Anti-HBc
IgM IgG

HBeAg

Anti-HBe

Значение

+

-

+ +

+

-

Остра инфекция

 

+

 

-

+ +

-

 

+

Остра инфекция с благоприятен изход

 

+

 

-

- +

-

 

+

Хронично носителство

-

-

+ +

-

-

Прозоречен период

-

 

+

- +

-

 

+/-

Имунитет след заболяване

-

+

- -

-

-

Постваксинален имунитет

 
 
 
 
Диагностика на хепатит D вирусната инфекция  
Рутинната диагностиката на хепатит тип D се основава главно на откриването на индиректни маркери на тази инфекция - антитела срещу HDV от класовете IgM и IgG. За целта се използват тестове, базирани на метода EIA. Директните методи за откриване на HDAg или HDV RNA в хепатоцитите или кръвното русло са недостатъчно стандартизирани или има проблем с надежността им като маркери на инфекцията, каквото е установяването на HDAg в кръвта (Табл. 1, Фиг. 3).  
 
При почти всички случаи на активна хепатит D вирусна инфекция се установява наличие на anti-HD IgM, като те се откриват само за определен период при остра инфекция, завършила с оздравяване (коинфекция), докато при хроничната форма на инфекция, тяхното наличие е свързано със смесена инфекция - хепатит тип В и тип Д, обикновено с по-тежко протичане. И в двата случая се откриват серологични маркери на хепатит В вируса. При фулминантна форма на хепатит, anti-HD IgM, могат да бъдат единствен индиректен маркер на HDV.  
 
Установяването на anti-HD антителата при вече приключила инфекция при липса на HBsAg, отразява прекарана в миналото HDV инфекция, като те са съпроводени с наличие за маркери на преминала HBV инфекция. Едновременното наличие на anti-HD от класовете IgM и IgG при наличието на HBsAg и други маркери на остра или хронична хепатит В вирусна инфекция говори убедително за наличие на смесена инфекция. В някои случаи специфичните anti-HDV антитела се явяват след острото начало на инфекцията, затова се налага повторно изследване след известен интервал, при съмнение за хепатит D вирусна инфекця.  
 
Табл. 2. Диагностичен профил на смесена HBV и HDV инфекция  
 

HBsAg

Anti-HBs

Anti-HD

Anti-HD IgM

Значение

-

+

+

-

Благоприятно приключила HBV/HDV инфекция

+

-

-

+

Остър хепатит тип D

+

-

+

+

Късна фаза на остър D хепатит.
Хроничен D хепатит

+

-

+

+/ -

Хроничен D хепатит

 
 
Диагностика на хепатит С вирусната инфекция  
Диагнозата на хепатит С вирусната инфекция се основава на откриване индиректни маркери на вируса – антитела срещу него или вирусна репликация – молекулярни методи за детекция на вирусния геном и неговата характеристика - генотипиране.  
 
Процедурата по диагностика на HCV започва с откриването на основния индиректен маркер на вируса – anti-HCV антитела от класа IgG с тестове, базирани предимно на имуноензимния метод (EIA). Наличието на anti-HCV антитела, заедно с клинико-лабораторни данни за възпалителен процес в черния дроб означава и наличие на хепатит С вирусна инфекция. Те се откриват при 98% от болните с наличие на HCV RNA (Фиг. 4).  
 
Откриването на HCV RNA, определя статуса на изследвания пациент по отношение наличието или липсата на вирусна репликация, като този етап от диагностичния процес е особено наложителен при асимптоматични пациенти или такива преболедували с изчистване на вируса, но все още положителни за anti-HCV антитела (15-30% от острите случаи). Острата хепатит С вирусна инфекция е трудна за диагностициране както поради липса на изразено клинически остро начало в по-големия брой случаи, така и поради липсата на специфичен маркер за остра инфекция. Хепатит С вирусната RNA е първият маркер на острата хепатит С вирусна инфекция, който се открива в кръвта около 15 дни от заразяването, след което болният става потенциален източник на инфекция (напр. чрез кръводаряване), при което липсват симптоми на чернодробна инфекция. Такава симптоматика се явява сравнително рядко след приключване на инкубационния период. Откриването на HCV РНК без наличието на anti-HCV антитела, е водещият индикатор за остра HCV инфекция при имунокомпетентни лица. Последващата след няколко седмици сероконверсия (поява на anti-HCV антитела), потвърждава напълно така поставената диагноза. Остра хепатит С вирусна инфекция може да се изключи при откриване само на anti-HCV антитела и липса на HCV RNA (за препоръчване тестирана двукратно), при използване на достатъчно чувствителна амплификационна техника (чувствителност <100 IU/ml). В такива случаи се отнася за преболедуване от HCV инфекция с оздравяване в минал период, като специфичните антитела в повечето случаи ще намалеят до пълно изчезване след години.  
 
Преобладаващият брой от пациентите, положителни за аnti-HCV антитела, имащи клинични и параклинични данни за остра или хронична чернодробна вирусна инфекция, са положителни и за HCV РНК, което е равнозначно на активна вирусна инфекция. Значителен брой индивиди с такава инфекция, нямат клинична симптоматика или ако има такава, тя се изразява само със слабо изразени неспецифични симптоми. Такава инфекция е особено характерна за лицата с хроничен хепатит С, в първите две-три десетилетия на заболяването.  
 
При диагностика в ранната фаза на хепатит С вирусна инфекция, чрез тестиране на anti-HCV антитела, остава “прозоречен” период между появата на HCV РНК и откриването на антителата, като времетраенето му е средно около 1.5 месеца. Откриването на нуклеиновата киселина на HCV (HCV РНК) става чрез тестиране на кръвни проби и/или от чернодробна биопсия чрез най-разпространения амплификационен метод - полимеразна верижна реакция (PCR), в неговия качествен или количествен вариант, както и с други молекулярни методи. Трябва да се обръща внимание на условията за транспортиране и съхранение на пробите за изследване, поради възможността от денатуриране на пробите при замразяване и размразяване, както и по-продължително съхраняване на стайна температура.  
Тестирането на HCV РНК се извършва както за диагностични цели, така и за мониториране на виремията по време на лечение на хепатит С вирусната инфекция. Намирането на HCV РНК в серума или черния дроб, потвърждава диагнозата - активна хепатит С вирусна инфекция, независимо от наличието или липсата на клинична симптоматика.  
 
Генотипът на HCV е една от основните характеристики на вируса и макар че определянето му не е задължителна процедура при поставянето на диагноза на хепатит С вирусната инфекция, е необходима стъпка преди започване лечението, предвид различното повлияване при лечение, съобразно генотипа на вируса.  
 
 
Фиг. 4. Серологичен профил при HCV инфекция с хронифициране