Прескочи към главното съдържание на страницата

Архив


БРОЙ 10 2009

Антифосфолипидни антитела и ехинококоза:
Има ли връзка между тях?

виж като PDF
Текст A
Д-р И. Макавеев, доц. д-р М. Даскалова, доц. д-р П. Петрова, доц. д-р Б. Нинов, доц. д-р Д. Стойков



В България ехинококозата прoдължава да бъде водеща хелминтозооноза, която нанася сериозни здравни и икономически щети. Интерес представлява фактът, че АФАТ са открити при сифилис, лаймска болест, някои хелминтози, малария, токсоплазмоза. Отделни съобщения за проучване на АФАТ има и при ехинококоза, но тяхната роля и възможна връзка с развитието на това заболяване досега не е изяснена. Целта на това проучване бе да се проследят нивата на антифосфолипидните антитела от класовете IgM и IgG чрез прилагане на ELISA техника в серуми на пациенти с различни форми на ехинококоза и да се потърси възможна връзка между наличието на тези антитела и развитието на ехинококоза. Проучени са серуми на 35 пациенти (16 мъже и 19 жени) на средна възраст 39.2 g. (+/-6.99) с доказана ехинококоза. За контроли са използвани серуми от 15 здрави лица на същата възраст. Статистически значими разлики (р<0.05), спрямо контролната група лица и за двата класа АФАТ (IgG и IgM), бяха установени в групата на пациентите с единични кисти на бял дроб.  
 
Ехинококозата е паразитно заболяване, което се причинява от ларвния стадий на цестода Echinococcus granulosus. Среща се в Азия, Африка, Южна и Централна Америка, Средна и Източна Европа, особено в Средиземноморския регион и в някои региони на Обединеното Кралство[1]. В България ехинококозата прoдължава да бъде водеща хелминтозооноза, която нанася сериозни здравни и икономически щети[2]. Паразитът може да се локализира в различни органи (черен дроб, бял дроб и всички останали възможни органи), където нараства бавно и образува кисти с различна големина и брой. Дългото прeживяване на Е. granulosus в човека показва, че съществува механизъм, който позволява на паразита да преодолее имунната защита на гостоприемника.  
 
Антифосфолипидният синдром е автоимунен феномен, който се характеризира с повтарящи се венозни и артериални тромбози, спонтанни аборти, тромбоцитопения и присъствие на антифосфолипидни антитела[3]. Антифосфолипидни антитела (АФАТ) от класовете IgМ и IgG са описани при инфекциозни заболявания (СПИН, лаймска болест, мононуклеоза), при автоимунни заболявания (системен лупус еритематодес, синдром на Сьогрен, ревматоиден артрит), при неврологични заболявания (миастения гравис) и в малък процент (12%) при клинично здрави хора. АФАТ са описани и при някои паразитози - малария[4,5,6], токсоплазмоза[7]. Отделни съобщения за проучване на АФАТ има и при ехинококоза[8,9], но тяхната роля и възможнашь връзка с развитието на това заболяване досега не е напълно изяснена. Това ни подтикна да изследваме наличието на антифосфолипидни антитела при пациенти с различни форми на ехонококоза.  
 
Цел  
Да се определят нивата на антифосфолипидните антитела от класовете IgM и IgG в серуми на пациенти с различни форми на ехинококоза и да се потърси възможна връзка с наличието на тези антитела, броя и локализацията на ехинококовите кисти при развитието на ехинококоза.  
 
Материал и методи  
I. Изследвани човешки серуми  
1.
Пациенти  
Серумите за изследване са получени предоперативно от 35 пациенти ( 16 мъже и 19 жени ) с ехинококоза на възраст 7-72 год. (средно 39.2 г +/-6.99). Диагнозата при всички случаи е потвърдена имунологично, оперативно, патохистологично или морфологично. Изследваните болни са пациенти на I-ва Хирургична клиника или яь консултирани в Паразитологичен кабинет при УМБАЛ Плевен и ДКЦ “Плевен”. Серумите бяха съхранявани при температура -20ºС до тестирането им.  
 
2. Здрави лица  
Като контроли бяха изследвани серумите на 15 здрави лица, без промени при рутинните биохимични лабораторни показатели, без aнамнеза за автоимунно заболяване и с нормални резултати от последното рентгенологично изследване на белите дробове и ехографско изследване на черния дроб, групирани съответно по пол и възраст.  
 
3. Ензим-свързан имуносорбентен тест (ELISA)  
Антифосфолипидни антитела от клас IgM и IgG бяха определени посредством търговския кит Byndazyme (Human Anticardiolipin IgM, Human Anticardiolipin IgG) Еnzyme Immunoassay Kit .  
 
Тестът изпълнихме според указанията на фирмата. Той включваше следните стъпала:  
- Изследваните серуми бяха разредени 1:100 с разтвора за разреждане на серуми.  
- На полистироловата плакар покрита с кардиолипинов антигенр бяха накапани калибриращите серуми, контролните и изследвани серуми, в обем 100 µl и инкубирани за 30 мин. на стайна температура.  
- Последва трикратно промиване с разтвора за промиване (50 mL промивен буфер, разреден в 950 mL дестилирана вода, съотношение 1:20) и подсушаване на плаката.  
- Инкубиране с имуноконюгата (заешки античовешки IgM или IgG пероксидазен конюгат), при стайна температура за 30 мин.  
- Трикратно промиване на плаката с разтвора за промиване и последващо подсушаване.  
- Инкубиране със субстрата 3, 3', 5, 5'-тетраметил бензидин (TMB) 100 µl за всяко кладенче, при стайна температура за 30 мин.  
- Трикратно промиване и последващо подсушаване.  
- Прекъсване на реакцията чрез прибавяне на 100 µl 3М ортофосфорна киселина.  
- Резултатите бяха отчетени 20 мин. след спиране на реакцията на Reader Ceres UV 900 C при дължина на вълната 450 nm, като получените стойности автоматично се преобразуваха в IU/ml. Според указанието на фирмата за референтна стойност се считат 10 IU/ml. Стойности над референтната бяха приети за позитивни.  
 
Статистически анализи  
Статистическият анализ изпълнихме, като използвахме програми EXCEL и Statgraphics Plus за Windows. Тестовете на Student, Duncan и Wilcoxon (W) използвахме за оценка на различията между групите. За ниво на статистически значимо различие бе прието p<0.05.  
 
Резултати  
Резултатите от проучването на антифосфолипидните антитела (АФАТ) при пациенти с различни форми на ехинококоза са отразени на Табл. 1 и Фиг. 1, 2, 3. АФАТ от клас IgM (Фиг. 1) бяха открити във всички изследвани групи: в групата с единични кисти на черен дроб при 9 пациенти (средна стойност 14.9 UI/ml), което е 50% от изследваните в тази група, при двама от четири пациенти с единични кисти на бял дроб (средна стойност 23.4 UI/ml), - 50% от изследваните, при тези с множествена/мултиорганна ехинококоза са трима от тринадесет пациенти (средна стойност 13.9 UI/ml) или 23% oт изследваните и само един от контролните серуми показа стойност 10.3 UI/ml по-висока от доверителния интервал (10 UI/ml) или 6.66%. Стойностите на АФАТ от клас IgG са представени на Фиг. 2.  
 
В групата с единични кисти на черния дроб при трима от пациентите нивата са по-високи от доверителния интервал (средно 13.8 UI/ml) или 16.6% от изследваните в тази група. Интерес представлява фактът, че всички четирима изследвани пациенти (100%) от групата с белодробна локализация на ехинококови кисти бяха положителни за АФАТ IgG със средна стойност 14.4 UI/ml, докато само един от тринадесет изследвани пациенти с множествена/мултиорганна ехинококоза показа стойност 11.9 UI/ml, по-висока от доверителната, което е 7.7% от изследваните за тази група. Нито един от петнадесет контролни серума не показа стойност, по-висока от доверителната cut off 10 IU/ml. Средната стойност на IgG АФАТ за контролната група изследвани лица е 4.8 UI/ml.  
 
Статистически значими разлики (р<0.05), спрямо контролната група лица бяха установени в групата на пациентите с единични кисти на белия дроб и за двата класа АФАТ (IgG и IgM). За АФАТ от клас IgG сигнификантни разлики (р<0.05) спрямо контролната група бяха установени и в групата с единични кисти на черен дроб. Незначителни са различията спрямо контролните и за двата класа АФАТ (p>0.05) при пациентите с множествена/мултиорганна ехинококоза. В групата с единични кисти на бял дроб положителни и за двата класа АФАТ са двама от изследваните пациенти (50%). При останалите групи пациенти позитивни за наличие и на двата класа антитела са по-малък брой пациенти. В групата с единични кисти на черен дроб само двама (11.1%), а при множествена/мултиорганна ехинококоза - един пациент (7.7%) (Табл. 1).  
 
Обсъждане  
Все още не е проучен точният механизъм на образуването на АФАТ при пациенти с ехинококоза. Известно е, че паразитите при инвазия на гостоприемника използват различни механизми, чрез които избягват или така моделират гостоприемниковия имунен отговор, че той дори улеснява тяхното преживяване и адаптация. Проучването на гостоприемниковия имунен отговор би допринесло да се улесни разкриването на онези критични въздействия, които паразитът използва при навлизане и продължително преживяване. Напоследък се появиха редица съобщения, които показват ролята на паразитните субстанции за поддържане на паразитната инвазия, супресия на някои имунни клетки или стимулиране на други клетъчни популации, свързани с патогенезата и патологията на заболяването[10,11,12]. В предишното наше съобщение на два случая с множествена ехинококоза ние показахме вероятна патологична автоимунизация към кардиолипин, която изглежда е улеснила дисеминацията на процеса[8], допринесла за фаталния изход.  
 
В това съобщение ние показваме наличието на сигнификантно по-високи стойности на антифосфолипидни антитела при пациенти с белодробна локализация на ехинококовите кисти в сравнение с останалите групи болни.  
 
Въпреки че дисеминацията на онкосферите се осъществява по хематогенен път, значителното повишаване на тези АФАТ при белодробна локализация може да отразява включването им в механизма, който улеснява дисеминацията и локализацията на паразита.  
 
Пациентите разделихме на групи според органната локализация и броя на кистите, за да намалим въздействието на други заболявания. В случая с белодробна локализация не изключваме други фактори като пушене, диета, богата на липиди и въглехидрати, стрес.  
 
Половината от нашите пациенти с единични кисти на белия дроб показаха високи стойности и за двата класа АФАТ (IgM и IgG), което ни дава основание да предполагаме ролята им при белодробна ехинококоза. Това наше предположение не корелира напълно с резултатите на други автори[5], които не намират връзка между ехинококоза и автоимунитет. От изследваните 70 серума на ехинококозно болни за антинуклеарни антитела (ANA) тези автори установяват положителни резултати само при 19 (27%) от изследваните пациенти, което не се различава от контролите 13 (18.8%). Бихме могли да обясним това различие по два параметъра:  
1. Селекцията на изследваните пациенти - всички изследвани от нас пациенти бяха със солитарни кисти, единични или множествени, за разлика от изследваните от Colebrook и Lightowlers[9], в различни стадии на ехинококовите кисти, съгласно класификацията на Caremaniet et al.[13].  
2. Видът на изследваните антитела - същите автори изследват антинуклеарни антитела, а ние - антикардиолипинови. Посочените различия в подходите не позволяват съпоставимост на получените резултати.  
 
 
КНИГОПИС:
 
1. Lorenzo C., B. Ferreira, Comparative analysis of the diagnostic performance of six major Echinococcus granulosus antigens assessed in a double-blind, randomized multicenter study., Journal of Clinical Microbiology, (2005), (Vol 43), No. 6, 2764-2770.  
2. Курдова Р., и съавт. - Състояние на паразитозите при хората в България през 2003-2005 г., Информационен журнал, 2006, 3, 5.  
3. Espinosa G., R. Cervera, J. Font, R. Asharson, The lung in the antiphospholipid syndrome., Annals of the Rheumatic Disease, (2002), (61), 195-198.  
4. Facer C., G. Agiostradidou. High levels of anti-phospholipid antibodies in uncomplicated and severe Plasmodium falciparum and in P. vivax malaria. Clin. Exp. Immunol., (1994), (95), 304-309.  
5. Grunewald T., G-R. Burmester, W. Schuler-Maue, F. Hiepe, F. Buttgereit. Anti-phospholipid antibodies and CD5+ B cells in HIV infection, Clinical Exp Immunology, 1999, 115(3), 464-471.  
6. Jakobsen P. H., D. Morris-Jones, L. Hviid, T. G. Theander, M. Hoier-Madsen, R.A.L. Bayoumi, B.M. Greenwood, Anti-phospholipid antibodies in patients with Plasmodium falciparum malaria, Immunology,1993, (79), 653-657.  
7. Barrile et al. - Presence and significance of anticardiolipin antibodies in infectious diseases, Rec. Progz. Med., (1992), (83), 350-353.  
8. Даскалова, М., и съавт. - Два клинични случая на Антифосфолипидни антитела и множествена ехинококоза, Инфектология, 2003, XL, 3, 24-27.  
9. Collebrook D.L., M. W. Lightowlers. Lack of an association between hydatid disease and autoimmunity. Parasite immunol. (1995), 17 , 4, 219-222.  
10. De Rosa FG, Amoroso A, Teggi A, Paparos B, Franchi C, Fergi GM, Caccavo D, Afeltra A. Anti-neutrofil cytoplasmic antibodies in echinococcus granulosus hydatid disease. Humm. Immunol 2001; 62(10): 1122-6.  
11. Meltowicka-Karna J, Kemona H., Does parasitic infection affect platelet factor 4 concentration? Rocz Acad Med Bialymst 2001; 46:126-32.  
12. Rigano R. et al - Modulation of human immune response by echinococcus granulosus antigen B and its possible role in evading host defenses., Infection and immunity, 2001, Vol.69, No 1, 288-296.  
13. Caremanti M, Benci A, Maestrini R, Rossi G, Menchetti D. Abdominal cystic hydatid disease(CHD): classification of sonographic appearance and response to treatment. J. clin. Ultrasound 1996; 24: 491-500.