Прескочи към главното съдържание на страницата

Архив


БРОЙ 2 2011

HPV инфекция на маточната шийка и възможности на съвременната диагностика

виж като PDF
Текст A
доц. д-р Н. Доганов



Целта на настоящия обзор е да се посочи биологичната значимост на HPV-инфекцията и нейната връзка с цервикалната онкогенеза, като се оценят диагностичните възможности на съвременните хибридизационни ДНК/РНК техники.  
 
Ключови думи: HPV, рак на маточната шийка, ДНК/РНК хибридизация.  
 
Ракът на маточната шийка (РМШ) е едно от най-разпространените онкологични заболявания в световен мащаб. По данни на СЗО 15% от неоплазмите при жените се падат на него. През последните 50 години в развитите страни се наблюдава 75% намаление на заболеваемостта и смъртността от РМШ, докато в развиващите се страни той е втората по честота причина за смърт от злокачествено заболяване. Това в голяма степен се дължи на мащабните програми за профилактика на РМШ в развитите страни, каквито на практика не съществуват в повечето от развиващите се страни. През 2002 г. в развиващите се страни са регистрирани 493 243 новозаболели (83% от нововъзникналите случаи в световен мащаб) и 273 606 са починали от РМШ. Анализът на разпространението по страни и региони показва, че в Африка, Централна и Южна Америка, Южна и Югоизточна Азия, РМШ е най-често срещаният карцином. Най-ниските нива на заболеваемост са в Северна Америка, Австралия, Близкия Изток и Западна Европа, докато в Източна Европа РМШ заема междинна позиция.  
 
В България по данни на Националния раков регистър, ракът на маточната шийка заема 2-ро място в структурата на гинекологичните неоплазии с честота 34.5% и e на 4-то място (7.7%) в общата онкологична заболеваемост при жените, с пик между 30-49-годишна възраст, като новозаболелите са 1 208, при фактическа заболеваемост от 30.4 на 100 000 жени, а починалите са 335 при смъртност от 8.4 на 100 000 жени. С по-висока заболеваемост са ракът на гърдата - 22.8%, на кожата - 9.7% и на ендометриума - 7.8%.  
 
Големият напредък на онковирусологията показва убедително, че в цервикалната онкогенеза основна роля играе хроничната инфекция с човешки папиломни вируси (HPV). Значимостта на HPV-инфекцията се определя от факта, че от регистрираните ежегодно в света нови пациентки с РМШ, връзката с HPV се открива в повече от 50% от случаите. Някои автори установяват данни за HPV инфекция в 99% от случаите с цервикален карцином.  
 
Човешките папиломни вируси (HPV) са ДНК вируси от семейство Papovaviridae, чийто гостоприемник са плоските и метапластични епителни клетки. Всички познати HPV вируси имат сходна структура и геномна организация. Техните вириони се състоят от двойноверижен циркулярен ДНК геном, съставен от 7800 до 7900 двойки бази и икозахедрален капсид. Вирусният геном се дели на три основни сегмента - два протеин кодиращи сегмента (“ранни” и “късни” генни сегменти) и некодиращ регулаторен сегмент. Некодиращият сегмент контролира транскрипцията на ранните и късни сегменти (ORFs-open reading frames, рамки на отворено четене) и по тозин начин регулира продукцията на вирусните белтъци и вирусните частици. ORFs са транскрипционни единици, които кодират белтъци и са означени като E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7.  
 
До момента се съобщава за около 200 различни типа HPV, от които 50 засягат гениталния тракт. Класифицирането им се осъществява на базата на фенотипни характеристики и нуклеотидната им последователност. Даден HPV геном се описва като нов тип, ако нуклеотидната последователност на E6, E7 и L1 гените се различава с повече от 10% от преди описаните видове.  
 
Според онкогенната си значимост HPV най-често се разделят в две групи. Първата включва HPV типове, които се свързват с доброкачествените кожно-лигавични изменения (тип 6, 11). Втората се свързва с изявата на предракови и ракови изменения, от които 20 се асоциират директно с РМШ. От тях типове 16 и 18 са отговорни за 70% от случаите с РМШ.  
 
Според онкогенния си потенциал W. Tjalma et al. (2004) разделят HPV типовете на три групи:  
•   Високорискови: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 75, 82.  
•   Вероятно канцерогенни: 25, 53, 66.  
•   Нискорискови: 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81.  
 
Острата HPV инфекция на гениталния тракт възниква, когато микротравма позволява на вируса да проникне в кожата или мукозата на гениталния тракт. Вирусът навлиза в клетките на базалния слой на епитела и съзрява, докато преминава през парабазалния, спинозния и гранулозния слоей на епитела. В гранулозния слой се осъществява репликацията на вирусната ДНК, синтезата на белтъците, кодирани от “късния” сегмент и формирането на вирусните частици. След остра HPV инфекция има три клинични варианти на развитие. Първият е развитието на латентна вирусна инфекция, когато HPV геномът се стабилизира като неинтегриран епизом и присъства в клетките на гостоприемника без клинични прояви и без да причинява морфологични изменения в плоския епител на гениталния тракт. Пациентите с латентна HPV инфекция нямат клинична изява, но в организма им присъстват HPV вируси, които могат да бъдат установени чрез ДНК тестване. Друг вариант на развитие е активната инфекция. Тя се манифестира с пролиферация на плоските епителни клетки и формиране на доброкачествени тумори (кондиломи). Това става при вегетативната репликация на HPV. В този случай вирусната ДНК е епизом и не се интегрира в ДНК на гостоприемника. При третия вариант високорисковите онкогенни типове на HPV се интегрират в генома на клетката гостоприемник. В резултат на вирусната интеграция, някои туморни супресори губят контрол над клетъчната пролиферация. Основна роля в този процес играят двата HPV гена от ранния сегмент - E6 и Е7. Както in vitro, така и in vivo проучвания сочат, че ролята на протеините E6 и Е7 на високорисковите HPV типове, са от жизнено значение за осъществяването на злокачествена клетъчна трансформация. Кодираните от Е6 и Е7 белтъци нарушават контрола на клетъчния цикъл, като блокират функцията на тумор супресорните протеини p53 и retinoblastoma (RB) (Vousden 1993). Съответно E6 инактивира p53, а E7-retinoblastoma. Инактивацията на туморсупресорните протеини води до нерегулирана клетъчна прогресия, нарушения в механизма на апоптозата и натрупване на генетични мутации. От съществено значение при тези процеси на канцерогенеза е действието на някои ко-фактори като тютюнопушене, сексуално трансмисивни инфекции (хламидии, гонококи, цитомегаловирус, херпес симплекс вирус и др.), репродуктивно поведение, хормонална терапия, имуносупресивни състояния, хранителен дисбаланс и др.  
 
Широкото разпространение на субклинични и транзиторни инфекции с HPV прави детекцията на вируса недостатъчно ефективно средство за идентифициране на жените с риск за развитие на РМШ. ДНК базираните методи за определяне на HPV показват само наличието на вируса, но не и онкогенната активност, тъй като не могат да разграничат активна от латентна или временна инфекция. По-новите технологии предлагат нова концепция, която се фокусира върху по-специфични рискови фактори. Установяването на E6 и E7 мРНК транскрипти на високорисковите HPV има по-добра предиктивна стойност относно развитието на високостепенни сквамозни интраепителни лезии и прогресия до цервикален карцином, в сравнение с ДНК детекцията.  
 
Доказването на биологичната значимост на папиломната инфекция, доведе до необходимостта от идентифициране ролята на отделните HPV типове, а с това и до бурното развитие на различните специализирани вирусологични техники.  
 
Първоначално в практиката навлязоха различни ДНК хибридизационни тестове с или без амплификация, с цел откриване на папиломавируси с нисък или висок онкогенен потенциал. По данни на Американската асоциация по колпоскопия и цервикална патология (ASCCP) чувствителността на HPV - ДНК тестване е от 83 до 100%, която е по-висока от тази на цитологията (67-85%), особено що се касае за определяне прогнозата при жени с цитонамазки, имащи неопределена значимост и високостепенна характеристика. Това позволи те да бъдат използвани като метод за цервикален скрининг (първичен скрининг) или да бъдат елемент от цитологичния цервикален скрининг[3,4].  
 
Въпреки добрите диагностични възможности на тези тестове, един от големите проблеми в определянето на по-нататъшното клинично наблюдение е, че не се знае кои от предраковите изменения ще прогресират, регресират или стационират.  
 
В тази връзка в последните години с развитието на РНК-технологиите за HPV типизация се постави ново начало в надеждите за оценка бъдещото развитие на вирус-асоциираните лезии.  
 
NASBA е технология, която позволява определяне на мРНК чрез специфична амплификация и детекция в реално време. Принципът на метода се основава на едновременното използване на ензимните активности на три ензима - обратна транскриптаза от вируса на птичата миелобластома (AMV-RT), рибонуклеаза H (Rnase H) и Т7 - РНК полимераза при изотермични условия (41°С).  
 
Продуктите на NASBA са едноверижни и затова могат да бъдат прилагани, без да се налага денатурация при методи за детекция, използващи хибридизация на сондата. Методът се състои от три основни компонента: екстракция на нуклеиновата киселина, амплификация и детекция.  
 
Основно предимство на NASBA е, че в сравнениe с PCR, изотермичността на процеса позволява всяка стъпка от реакцията да се извършва веднага след като амплификационният междинен продукт е налице. Това осигурява експоненциална кинетика на NASBA процеса, която е по-ефективна от ДНК амплификационните методи, които се ограничават до бинарно увеличение на таргетната нуклеотидна последователност за един цикъл.  
 
Недостатък на метода, както и при другите РНК базирани амплификационни методики е стабилността на РНК, която може да се засегне по време на събиране, съхранение обработка и транспортиране на пробите което води до фалшиво отрицателни резултати. За да се преодолеят проблемите с РНК стабилността са разработени NASBA методики, при което са създадени диагностични набори със стандартизирани реагенти. Друг недостатък на метода е, че дължината на търсената РНК трябва да бъде от 120-250 нуклеотида. При по-голяма или по-малка дължина ефективността на амплификацията е по-малка.  
 
Въпреки посочените недостатъци първите проучвания, сравняващи диагностичните възможности на PCR-ДНК real-time и NASBA показват, че установяването на HPV ДНК с RT - PCR дава положителен резултат в 71% от случаите, докато NASBA само в 14% (Sonia Andersen et al. 2006).  
 
Тези резултати дават надежда, че NASBA има по-високата предиктивна стойност при определяне на онкологичния риск при бъдещата еволюция на измененията.  
 
 


КНИГОПИС:

1.   Златков, В., П. Костова. Профилактика, скрининг и ваксини при предрака и рака на маточната шийка, Българска издателска къща, София. 2006, 149.  
2.   Eduardo L. Franco, Eliane Duarte-Franco, Alex Ferenczy. Cervical cancer: epidemiology, prevention and the role of human papilloma virus., McGill University, Montreal, Que. 2001.  
3.   Tjalma WA, et al. Prophylactic human papillomavirus vaccines: the beginning of the end of cervical cancer. Int J Gynecol Cancer. 14, 2004, 751-61.  
4.   Dillner J., P. Sparen, M. Arbyn. HPV DNA detection. In: European guidelines for quality assurance in cervical screening, European Comission, Health & Consumer Protection Directorate-General, Luxembourg, 2003, 100-123.  
5.   Remmink, A. et al. The presence of persistent high-risk HPV genotypes in dysplastic cervical lesions is associated with progressive disease: natural history up to 36 months. Int J Cancer. 61: 1995, 3, 306-311.  
6.   R. E. Bristow, F. J. Montz, Human papillomavirus: molecular biology and screening applications in cervical neoplasia—a primer for primary care physicians. Elsevier Science Inc., 1998.  
7.   O. Chakrabarti, S. Krishna. Molecular interactions of ‘high risk’ human papilloma viruses E6 and E7 oncoproteins: implications for tumor progression; J Biosci. 28-337-348.  
8.   S. Andersson, B. Hansson, I. Norman, V. Gaberi, M. Mints, A. Hjerpe, F. Karlsen, B. Johansson. Expression of E6/E7 mRNA from ‘high risk’ human paillomavirus in relation to CIN grade, viral load and p16INK4a. International journal of oncology 29: 705-711, 2006.  
9.   K. Loens, D. Ursi, H. Goosens, M. Leven. Nucleic Acid Sequence-Based Amplification. Medical Biomethods Handbook. Humana Press, Inc.,Totowa, NJ. 2005.