Прескочи към главното съдържание на страницата

Архив


БРОЙ 4 2013

Анти-колагенови тип IV антитела и развитие на микроваскуларни усложнения при пациенти със захарен диабет тип 2 и артериална хипертония

виж като PDF
Текст A
Д-р А. Николов¹, доц. д-р И. Цинликов¹, д-р И. Цинликова¹, д-р Г. Николов2, д-р А. Блажев2, д-р С. Станилова3, д-р М. Ангелова4, д-р А. Гарев¹



Ключови думи: Захарен диабет тип 2, артериална хипертония, анти-колагенови ИгГ антитела, съдови увреждания.  
 
Въведение и цели: Задебеляването на базалната мембрана на капилярите и малките съдове е добре позната находка и важен компонент в прогресията на диабетната микроангиопатия. Пациентите със захарен диабет (ЗД) и артериална хипертония (АХ) са в по-висок риск за развитие на съдова болест.  
 
Материал и методи: За мониториране метаболизма на основния базално мембранен протеин-колаген тип IV (КIV) при пациенти със ЗД тип 2, както и за регистриране на серумните нива на антителата срещу КIV фрагменти от субкласовете ИгГ, ИгМ и ИгА, беше изпозван ELISA методът при 93-ма пациенти със ЗД тип 2 и АХ (средна възраст 61.4+/-11.3 години; продължителност на диабета 9.88+/-3.12; продължителност на хипертонията 9.28+/-4.98). Тези стойности бяха сравнени с тези на 42 възрастово и полово съвпадащи контроли. Диабетиците бяха разделени на две групи според наличието - Група 1 (n=67) или отсъствието - Група 2 (n=26) на микроангиопатия.  
 
Резултати: Пациентите със ЗД тип 2 и АХ показаха значимо по-високи нива на анти-КIV ИгГ, в сравнение със здравите контроли (0.30+/-0.12 срещу 0.21+/-0.08); (р=0.0001). Група 1 показа значимо по-високи нива на анти-КIV ИгГ, отколкото Група 2 (0.32+/-0.13 срещу 0.24+/-0.08); (р=0.009) и здравите контроли (0.32+/-0.13 срещу 0.21+/-0.08); (р=0.0001). Нивата на анти-КIV ИгГ са значимо по-високи при диабетиците с ретинопатия, отколкото при тези без (0.33+/-0.10 срещу 0.26+/-0.13) (р=0.04). Анти-КIV ИгГ корелира с продължителността на диабета (r=0.49); (p=0.0004), ретинопатията (r=0.20); (p=0.05) и BMI (r=0.24); (p=0.05). Серумните нива на анти-КIV ИгМ и ИгА при пациенти със ЗД тип 2 и АХ бяха по-ниски, отколкото при контролите, но тези разлики не са статистически значими.  
 
Изводи: Нашето проучване показа връзка между повишените серумни нива на анти-КIV ИгГ при диабетици и развитието на микроангиопатия.  
 
Клиничните манифестации на микро- и макроваскуларно увреждане при захарен диабет (ЗД) включват ретинопатия, нефропатия и бързо развиваща се атеросклероза. Възможните последици от горните са слепота, бъбречна дисфункция, миокарден инфаркт, инсулт, ампутация на крайници. Тези манифестации в таргетните органи показват общи патологични характеристики, които са в основата на всички съдови заболявания. Въпреки това, всяко усложнение има свои отличителни черти,в зависимост от замесената тъкан, както и специфично насочени превенция и лечение, Mario and Pugliese, 2001[1]. Това разнообразие е подкрепено от ясните епидемиологични характеристики на съдовите усложнения, които са различно проявени при диабетно болните, Toeller et al.,1999; Laasko, 1999[2]. Разпространението на съдовите усложнения също варира, в зависимост от ангажираното място. Макроангиопатията е понякога представена по време на поставяне на диагнозата, особено при ЗД тип 2 (инсулин независим)[2], докато микроваскуларните усложнения обикновенно се развиват няколко години след началото на диабета, Krolewski et al., 1987[3]; Hanefeld et al., 1996[4]. От друга страна, докато развитието на ретинопатията се увеличава с продължителността на диабета, тази на нефропатията достига връх след около 15 години, след което намалява. Отношението на развитието и тежестта на съдово заболяване са също зависими от индивидуалните харектеристики на индивида. Някои пациенти развиват само начални лезии, докато други прогресират до крайните стадии на заболяването, дори и да са на сходно метаболитно ниво.  
 
Артериалната хипертония и диабетните съдови усложнения са свързани с повишени нива на разграждане на еластичните фибри. В резултат на това, колагенови тип IV (КIV) фрагменти са освобождавани в кръвообръщението, което е патологичен стимул за повишена продукция на автоантитела срещу епитопите на К IV. Тъй като е изключително важно да бъдат намерени характеристиките на патологична активация на колагеновата промяна при диабетици, ние проследихме диабетици с артериална хипертония и съдови усложнения.  
 
При ЗД, задебеляването на базалната мембрана на капилярите и малките съдове е добре позната патоанатомична промяна и важна в прогрсията на диабетната микроангиопатия. Колаген тип IV е широко представен в базалните мембрани и е техен основен структорен елемент, Paulsson, 1992[5]; Kuhn, 1995[6]. Метаболитната промяна на КIV резултира в микро- и макроваскуларните усложнения на диабетно болните.  
 
Еластинът и колагенът са основните протеини на съдовата стена. Важен фактор за възникването на промени в последната е деградацията на главния екстацелуларен матриксен протеин-колеген, Rosenbloom et al., 1993[7]. Базалната мембрана регулира функциите на много клетки и медиира взаимодеиствията между различните тъкани, Paulsson, 1992[5]; Kuhn, 1995[6]. Колаген тип IV е главният компонент на базалните мембрани, Schuppan and Riecken, 1990[8]. Измерването на серумните антитела към фрагменти от КIV сега е възможно и позволява промените да бъдат установени, Balashova et al., 2000[9]; Nicoloff et al., 2002[10].  
Базираики се на широкото представителство на колагена в базалните мембрани[6,8], са разработени няколко имунологични метода за детекция на циркулиращи фрагменти от КIV, Risteli L. etal., 1987[11]. Регистрирането на циркулиращи КIV молекули и фрагменти в серума на диабетици, Alland A., Matsumoto E., Nicoloff G.,[12,13,14] показа, че КIV макромолекулите не са напълно разградени от колагеназите in vivo. Тези КIV биха могли да се превърнат в стимул за имунокомпетентните клетки,което би рефлектирало върху продукцията на анти-КIV антитела.  
 
Има данни за регистриране на серумни КIV фрагменти при животни и хора с артериална хипертония, Hasslacher et al., 1987[15]; Yano et al., 1997[16]. Тези фрагменти е възможно да се превърнат в силен стимул за имунокомпетентните клетки, водещ до патологична продукция на анти-КIV антитела.  
 
Изследователите Susamu et al., 2003[20] измерили серумните анти-КIV ИгГ при диабетно болни и установили, че тези нива са значимо повече при диабетици, отколкото при здрави контроли. Въпреки това, не е установена връзка между степента на албуминурията и серумните нива на анти-КIV ИгГ.  
 
Ние изследвахме анти-КIV антителата при деца с есенциална хипертония. Пациентите показаха значимо по-високи нива на анти-КIV ИгМ, докато нивата на анти-КIV ИгГ бяха по-ниски от тези на контролите, Nicoloff et al., 2006[21].  
В настоящото проучване, се опитахме да открием дали серумните нива на антитела (ИгМ, ИгГ и ИгА) към епитопи на КIV са свързани с развитието на диабетна микроангиопатия. Това проучване установи нормалните серумни нива на анти-КIV в здравите субекти и сравни получените резултати с тези на диабетно болни пациенти, както и на такива, страдащи от артериална хипертония. Наблюдаваните промени корелират с диабетните микроваскуларни усложнения.  
 
Материал и методи  
Субекти
 
Експерименталната група се състои от 93-ма пациенти (37 мъже, 56 жени) със ЗД тип 2 и артериална хипертония (средна възраст 61.4+/-11.3 години;с продължителност на диабета 9.88+/-3.12 години; продължителност на хипертензията 9.28+/-4.98). За контроли са изпозвани 42-ма субекти, съвпадащи по пол и възраст с изследваната група, без анамнеза за диабет, атеросклероза или емфизем. Диабетиците са разделени на две групи според наличието (Група 1, n=67) или отсъствието (Група 2, n=26) на микроваскуларни усложнения (Табл. 1). Група 1 се състои от 39% мъже и 61% жени. 55% са пушачи и 45% непушачи. Група 2 се състои от 42% мъже и 58% жени. 58% са пушачи и 42% непушачи. Контролите се състоят от 45% мъже и 55% жени. 27% са пушачи и 73% непушачи (Табл. 2). Микроалбуминурията е формулирана като персистираща уринарна албуминова екскреция за минута в рамките от 20 до 200 мкргр./мин. в стерилна урина. Никой от пациентите нямаше диагноза за бъбречно заболяване, несвързано с диабета, по време на нашето проучване.  
 
Клиничен драфт  
Всички пациенти пребиваваха в района на Плевенската университетска болница. Серумите на субектите бяха взети от октомври 2011 г. до май 2012 г. Етично одобрение беше изискано от местната етична комисия и всички пациенти дадоха информирано писмено съгласие преди извършването на нашето проучване.  
 
Процедура  
Серумните антитела (ИгГ, ИгМ и ИгА) към КIV бяха определени по ELISA метода. Накратко, всяка сонда от микротитър чинията беше сензитирана с 100 микролитра от 10 мкргр./мл. от човешки КIV (SIGMA, USA) на стайна температура за 3 часа, последвано от инкубация през нощта на 40C. Плаката беше измита с фосфатно буфериран физиологичен разтвор (ФБФР), съдържащ 0.05% Tween 20 и 1% говежди серуменалбумин (ГСА, SIGMA, USA). След това, 100 мкрл. серумна проба (разредена 1:10), беше поставена във всяка сонда от микротитърната чиния и инкубирахме за 1 час на 370C. След измиване три пъти, 100 мкрл. от имуноконюгатите (анти-човешки имуноглобулин пероксидаза конюгати (SIGMA, USA) към тежката верига на ИгГ, ИгМ и ИгА) бяха добавени към всяка сонда за 1 час на 370C. Всички имуноконюгати бяха разредени 1:10,000 с ФБФР, съдържащ 1% ГСА и 0.05% Tween 20. Плаката беше инкубирана за 1 час на 370C. о-фениленедиамин (0.4 mg/ml) беше добавен към цитратен буфер и 100 мкрл. от този разтвор бяха добавени към всяка сонда, след което бяха оставени 30 мин. за протичане на реакциите. Реакцията беше спряна чрез прибавяне 50 мкрл. 4 М H2SO4 към всяка сонда и оптичната плътност беше оценена с Microelisa Reader 210 (Organon Teknika,Belgium) на дължина на вълната 492 nm. Анти-КIV нива по-високи от средно +/-2SD от здравите контроли бяха определени като положителни.  
 
Офталмоскопия при разширени зеници беше проведена при всички пациенти със ЗД, за да бъде оценено наличието или отсъствието на ретинопатия. Всички пациенти бяха изследвани от един и същ офталмолог. Хемоглобин А1с беше установен чрез течна хроматография под високо налягане (нормален обем 4-6%). Тоталният серумен холестерол и триглицеридните концентрации бяха установени с ензимен анализ (Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany). Артериалното кръвно налягане беше изследвано със стандартен живачен сфингоманометър до най-близките 2 mm Hg, на доминантната ръка след най-малко 10 мин. почивка в супинирана позиция. Персистиращата албуминова екскреция беше определена с нефелометрия, изпозвайки кит, съдържащ спцифично антитяло (Behringwerke, Marburg, Germany).  
 
Статистически анализ  
Всички стойности са изразени като средно +/-SD. Статистическите анализи бяха направени с програмите EXCEL, STATGRAPHICS plus за WINDOWS. The Student t-test и ANOVA бяха изпозвани, за да оценят разликите между групите. Корелацията и регресивният анализ също бяха използвани. Нивото на значимост беше определено като p<0.05.  
 
Резултати  
Пациентите със ЗД тип 2 и АХ показаха значимо по-високи нива на анти-КIV ИгГ, в сравнение със здравите контроли (0.30+/-0.12 срещу 0.21+/-0.08); (р=0.0001). Група 1 показа значимо по-високи нива на анти-КIV ИгГ, отколкото Група 2 (0.32+/-0.13 срещу 0.24+/-0.08); (р=0.009) и здравите контроли (0.32+/-0.13 срещу 0.21+/-0.08); (р=0.0001). Група 2 показа по-високи нива на анти-КIV ИгГ, в сравнение с контролите (0.24+/-0.08 срещу 0.21+/-0.08); (р=0.05). Анти-КIV ИгГ корелира с продължителността на диабета (r=0.49); (p=0.0004), ретинопатията(r=0.20); (p=0.05) и BMI (r=0.24); (p=0.05) (Таблица 3). Всички диабетни пациенти (n=93) бяха разделени на две подгрупи, в зависимост от данните за ретинопатия: пациенти с ретинопатия (n=20) и пациенти без ретинопатия (n=73) според класификацията на Европейската Асоциация за Изучаване на Диабета (EASD). Нивата на анти-КIV ИгГ са значимо по-високи при диабетиците с ретинопатия, отколкото при тези без (0.33+/-0.10 срещу 0.26+/-0.13) (р=0.04) (Табл. 4). Серумните нива на анти-КIV ИгМ и ИгА при пациенти със ЗД тип 2 и АХ бяха по-ниски, отколкото при контролите, но тези разлики не са статистически значими (Табл. 5 и 6).  
 
Дискусия  
Епидемиологични проучвания показаха строга корелация между затлъстяването и сърдечно-съдовите заболявания, както и между затлъстяването и специфичните сърдечно-съдови рискови фактори като високото артериално налягане и захарен диабет (ЗД). При диабетни пациенти заболяваемостта и смъртността са основно свързани с развитието на късните усложнения, в частност макро- и микроангиопатия. Захарният диабет (Тип 1 и Тип 2) е сред главните рискови фактори за сърдечно-съдово заболяване. В проучването на Framingham The Framingham Study, 1979[17], рискът за сърдечно-съдово заболяване се удвоява при диабетно болни.  
 
Имуногенните свойства на колагените са познати при животни. Антитела срещу различни колагенови молекули са представени в човешкия серум при някои заболявания, особено тези с автоимунна генеза Moreland et al., 1991[18]; Yang et al., 1993[19]; Daskalova et al., 1997[22] .Откриването на фрагменти от КIV в животински и човешки серуми с артериална хипертония Hasslacher et al., 1987[15]; Yano et al., 1997[16] показва, че макромолекулата на КIV не е пълноценно разградена от колагеназите in vivo. Тези КIV фрагменти биха могли да представляват повишен потенциален стимул за имунокомпетентните клетки, отключвайки патологична продукция на автоанти-КIV антитела. Промени на нивата и съотношението на субкласовете КIV-автоантитела са възможни да бъдат наблюдавани във времето.  
 
Колаген тип IV е от главните компоненти на базалните мембрани и съединителната тъкан. Той е съставен от 7S участък, включващ четири аминотерминални полипептидни вериги, свързани помежду си в антипаралелна групировка,и глобуларен карбокситерминален свързващ домейн, Sato et al., 1997[23]. Колагеновата микрофибрила представлява организация от четири или пет колагенови молекули, разположени по своята дължина и свързани с гликопротеини, Stanley RG, 2009[24]. Колагеновият катаболизъм не е така пълно изучен, както колагеновия синтез, Labasse A., 2007[25]. Колагеновият катаболизъм е сложен и многостъпален процес.Той протича не само на интрацелуларно ниво, но и в екстрацелуларния матрикс. Интрацелуларното разграждане на колагена започва с активацията на високо специфични колагенази,взаимодействащи с колагеновите молекули, Weis etal., 2001[26].  
Предметът на проучването на Yano et al. през 1997 г.[16] беше да определи серумните нива на 7S домейна на КIV при пациенти с есенциална хипертензия и такива с ЗД тип 2, с или без повишени стойност на артериалното налягане, и да изясни връзката между обмяната на КIV и артериалното кръвно налягане. Серумните нива на 7S-колагеновия домейн при 18 пациента с есенциална хипертония бяха значително по-високи в сравнение с 24 здрави контроли. Имаше значителна корелация между серумните 7S-колагенови нива и систолното кръвно налягане в случаите на есенциална хипертония. В нашето проучване, измерихме нивата на анти-КIV антителата при пациенти със ЗД и АХ. Пациентите с микроваскуларни усложнения показаха значително по-високи нива на анти-КIV ИгГ в сравнение с другите групи. Пациентите със ЗД тип 2 са с висок риск от развитие на диабетна микроангиопатия и съдова болест. Съдовите усложнения обикновенно се развиват няколко години след началото на ЗД тип 2, Klein et al., 1984[27]. В настоящото проучване, открихме значима връзка между серумните нива на анти-КIV ИгГ и развитието на диабетна ретинопатия.  
 
Възможно е това да се дължи на последователността в имунния отговор и неговия профил. Първият субклас имуноглоболини, синтезирани от патологично активираните имунокомпетентни клетки е ИгМ, след което имунната система превключва на ИгГ. В този ред на мисли, покачването на анти-КIV ИгМ е първият обективен показател за патологична промяна в колагеновата молекула и развитието на микроваскуларни усложнения. Клетъчно-медиираният имунен отговор се опосредства от фагоцити, Т-ефекторни клетки, NK-клетки и др. Те притежават рецептори за Fc-фрагмента на ИгМ и взаимодействат преференциално с разтворими и имобилизирани имунни комплекси от ИгМ и фрагменти на КIV. Следователно, присъствието на анти-КIV антитела би довело до разнообразни патологични процеси, включително формирането на имунни комплекси.  
 
В настоящото проучване нивата на анти-КIV ИгГ са статистически значимо по-високи при диабетици с ретинопатия. Тези пациенти са развили ретинопатия преди нашите измервания и вероятно не са в най-ранния стадий от развитието на микроваскуларното заболяване. Следователно, покачването на серумните нива на анти-КIV ИгГ е следващият индикатор за патологичната промяна на колагена.  
 
Доказано е, че протеини, включително имуноглобулини, акумулират в междуклетъчния матрикс, задебелявайки стените на малките съдове на кръвообръщението при диабетни пациенти, Brownlee et al., 1983[28]. ИгГ свързва преференциално базалните мембрани, съдържащи гликирани крайни продукти, Brownlee et al., 1993[29]. Продъжителната хипергликемия рефлектира върху образуването на гликирани колагенови молекули-част от т.н. късни продукти на неензимното гликиране-AGEs, Airaksinen et al., 1993[30]. Имуноглобулините свързват така модифицирания колаген. По този начин, те увеличават местата за свързване на други молекули към комплекса и разширяват матрикса, натрупваики се в него. Макрофагите реагират с новите епитопи по повърхността на КIV молекулите (КIV с AGEs) и освобождават монокини, тумор некротизиращ фактор и интерлевкин-1. Последният неспецифично стимулира патологичната продукция на нови количества анти-КIV ИгГ, които ще реагират с нови епитопи, или вероятно ще реагират кръстосано с ‘нормални’ епитопи от молекулата на КIV. Обобщено, гликирането на КIV в базалните мембрани е основният процес,довеждащ до диабетни микроваскуларни усложнения. Повишеният синтез и/или повишеното разграждане на КIV биха предизвикали покачващите се серумни нива на КIV фрагменти, които са силен патологичен стимул за продукцията на специфичните антитела, открити в нашето проучване, главно при пациенти с ретинопатия.  
 
Сравняваики пре-хипертонични пациенти със здрави индивиди, С. Тишева 2004[34] откри, че количествата на еластин деградационните продукти (ЕДП) са значимо повишени в първата група. Това свидетелства за повишена елстолиза като промените настъпват преди манифестирането на хипертонията. При пациенти с умерено повишени стойности на артериалното налягане еластиновият метаболизъм е небалансиран. Повишеното количество ЕДП и високите нива на антиеластинови антитела могат да бъдат стабилизирани. Пациентите с АХ, сравнени с тези в пре-хипертонично състояние и здравите контроли,показват значимо по високи серумни нива на ЕДП, ИгА-антиеластинови антитела, ИгА-антиколагенови тип IV антитела, ИгГ-антиколагенови тип I и ИгГ-антиколагенови тип III антитела. Това е белег за нарушения интегритет на фибрилната структура на съдовата стена.  
 
E. Mekenyan, 2012[35] изучава еластиновата и колагеновата промяна при пациенти с метаболитен синдром и открива корелация между анти-еластиновите, анти-тропоеластиновите и анти-КIV-ИгГ и серумните нива на триглицеридите, както и корелация между анти-AGE-ИгГ и ИгМ и нивата на серумните триглицериди. Горните данни доказват асоциацията между стареенето на съдовете и атерогенното състояние на дислипидемията, характеризиращо метаболитния синдром.  
 
В нашето проучване ние открихме повишени нива на анти-КIV-ИгГ антитела при диабетици с ретинопатия. Тези открития се подкрепят от резултатите на Blashova et al., 2000[11] сред пациенти с преклинична, непролиферативна, препролиферативна и пролиферативна диабетна ретинопатия. Авторите откриха, че диабетната ретинопатия се съпътства с отчетливо покачване в активността на хуморалния имунен отговор, асоцииращо се с появата на антитела към колаген тип II и IV в слъзната течност и серума с преобладаващи „местни” реакции. Нивото на активиране и включване на клетъчно-медиирания автоимунен отговор в процеса (чрез тумор некротизиращия фактор-алфа и клетъчните реакции) в слъзната течност и серума остана ниско. Според авторите, повишените нива на циркулиращи имунни комплекси в серума и почти пълното отсъствие на свободни антиколагенови антитела в кръвта може да бъде индикатор за формирането на патогенни имунни комплекси, преципитиращи в съдовите стени и други тъкани.  
 
Анти-КIV-ИгГ антитела показаха значима връзка с продължителността на диабета и BMI. Повишените средни нива на триглицеридите и тоталния холестерол, извън нормалните си граници, открити по време на проучването, корелират с развитието на диабетни съдови усложнения, както е описано от Steiner през 1997 г.[31]. Добре известно е, че хипертриглицеридемията е сред най-честите нарушения при лошо контролирания диабет.  
 
В нашето проучване не беше възможно да наблюдаваме ‘активната’ фаза на съдовите усложнения, защото нашите пациенти са с продължителност на диабета 9.88+/-3.12 години. По време на „активната” фаза вероятно нивата на анти-КIV ИгМ са били завишени, докато през хроничния период нивата на последния са ниски и единствено тези на анти-КIV ИгГ са завишени.  
 
Нашето проучване показа връзка между серумните нива на анти-КIV ИгГ и развитието на диабетна ретинопатия. Наличието на горните антитела би довело до разнообразни патологични процеси, включително образуването на имунни комплекси, активиране на комплемента и активация на К-клетъчно-медиирана-антитяло-зависимата клетъчна цитотоксичност. Всички тези процеси могат да допринесат за колагеновата деструкция в артериалната стена. Още повече, колагеновите антигени, презентирани на увредените места от съдовата стена, са открита мишена за специфични Т и Б лимфоцити,които биха могли да усилят имунния отговор, Peterszegi et al., 1997[32,33].  
 
Определянето на маркерите на екстрацелуларният метаболизъм би позволило постигането на по-тесен контрол на кръвнозахарното ниво и търсене на дискретни начални лезии сред пациентите, които са предразположени към усложнения, в сравнение с тези, които не са. Разбирането на връзката между хипергликемията, промененият модел на експресия на различни медиатори и нарушената регулация, водеща до процеси на ремоделиране в съдовата стена на нивото на таргетната тъкан, би позволило подобрение на терапията, насочено на тъканно ниво и съобразено с индивидуалните биохимични, структурни и функционални особености на пациента.  
В заключение, нашите резултати показват асоциация между нивата на анти-КIV ИгГ и развитието на лезии в съдовата стена. Елевацията на анти-КIV ИгГ би могла да бъде индикатор за повишената колагенова деструкция и развитието на микроваскуларни усложнения.  
 
 
КНИГОПИС:
 
1. Di Mario U, Pugliese G. 15thGolgi lecture: from hyperglycemia tothe dysregulation of vascular remode-lling in diabetes. Diabetologia. 2001Jun;44(6): 674-692. [PubMed].  
2. Toeller M, Buyken AE, HeitkampG, Berg G, Scherbaum WA. Prevalenceof chronic complications, metaboliccontrol and nutritional intake in type 1diabetes: comparison between differentEuropean regions. EURODIABComplications Study group. HormMetab Res. 1999 Dec;31(12): 680-685.  
3. Krolewski AS, Warram JH, RandLI, Kahn CR. Epidemiological approachin the etiology of type 1 diabetesmellitus and its complications. N EnglJ Med. 1987 Nov 26;317(22):1390-1398.  
4. Hanefeld M, Fisher S, Julius U, Schulze J, Schwanebeck U, SchmechelH, et al. The DIS Group. Risk factorsfor myocardial infarction and death innewly detected NIDDM: DiabetesInternational Study, 11-year follow-up. Diabetologia. 1996 Dec;39(12):1577-1583. [PubMed].  
5. Paulsson M. Basement membraneproteins: structure, assembly, andcellular interactions. Crit Rev BiochemMolec Biol. 1992 27(1-2):93-127. [PubMed].  
6. Kuhn K , Basement membrane(type IV) collagen. Matrix Biol. 1995Feb;14(6): 439-45. Review.  
7. Rosenbloom J, Abrams WR, Mecham R. Extracellular matrix 4: theelastic fiber. FASEB J, 19938. Schuppan D, Riecken EO. Molecules of the extracellular matrix: potential role of collagens andglycoproteins in intestinal adaptation. Digestion. 1990;46(Suppl 2):2-11. [PubMed].  
9. Balashova L, Zaitseva N, Teplinskaia L, Koval’chuk L, Gankovskaia L, Obraztsova E, Aronskind M. Antitela k kollagenu II iIV tipov, faktor nekroza opukholi al’fai tsirkuliruiushchie immunnyekompleksy v sleze i syvorotke krovi ubol’nykh s razlichnymi stadiiamidiabeticheskoi angioretinopatii. VestnOftalmol 2000; 116, 31-34. [in Russian]  
10. Nicoloff G, Baydanoff S, PetrovaCh, Christova P. Serum antibodies tocollagen type IV and development ofdiabetic vascular complications inchildren with Type 1 (insulin-depen-dent) diabetes mellitus - a longitudinalstudy. Vascular Pharmacology. 2002Mar;38(3):143-147.  
11. Risteli L, Risteli J. Analysis ofextracellular matrix proteins inbiological fluids. Methods Enzymol. 1987; 145:391-411. [PubMed].  
12. Alland A, Hartmann DJ, LoupyG, Lechevalier D, Ville G, Cotisson A, et al. Etude de la fibronectine etducollagene de type IV plasmatiqueschez le diabetique. Path.Biol. (Paris). 1984 Feb;32(2):115-121. [Article inFrench] [PubMed].  
13. Matsumoto E, Matsumoto G, Bessho H, Kikuoka H, Nanjo K. Serumconcentrations of intact type IVcollagen in diabetics. J DiabetComplications. 1991; 5:189-190  
14. Nicoloff G, Baydanoff S, Stanimirova N, et al. Serum collagentype IV in healthy children and childrenwith insulin-dependent diabetesmellitus. Clin. Appl. Immunol. Invest. 2001; 1:165-168.  
15. Hasslacher C, Brocks D, MannJ, Waldherr R. Influence ofhypertension on serum concentrationof type IV collagen antigens instreptozotocin-diabetic and non-diabetic rats. Diabetologia. 1987May;30(5):344-347. [PubMed].  
16. Yano Y, Ura H, Sumida Y, Gabazza EC, Misaki M, Shima T. Serum7S domain of type IV collagen levels inessential hypertension and hypertensive type 2 diabetic patients. DiabetMed. 1997 Jun; 14(6):466-71. [PubMed].  
17. Kannel WB, McGee DL. Diabetes and cardiovascular riskfactors: the Framingham study. Circulation. 1979 Jan;59(1):8-13. [PubMed] [CrossRef].  
18. Moreland LW, Gay RE, Gay S. Collagen autoantibodies in patientswith vasculitis and systemic lupuserythematosus. Clin Immun Immunopathol. 1991 Sep;60(3):412-418.  
19. Yang CL, Brinckmann J, Rui HF, Vehring K, Lehmann H, Kekow J, et al. Autoantibodies to cartilage collagensin relapsing polychondritis. ArchDermatol Res. 1993; 285(5):245-249.  
20. Susumu T, Uchugu T, Shoichi T, Measurement of Serum Anti-type IVCollagen Antibody in Diabetic Patients, Annals of Gunma University School ofHealth Sciences, V24.;87-91(2003).  
21. Nicoloff G, Angelova M, Christova I, Nikolov A, Alexiev A. Serum cobalt in children with essentialhypertension, Am J Hum Biol. 2006Nov-Dec;18(6):798-805. [PubMed]  
22. Daskalova M, Taskov H, Dimitrova E, Baydanoff S. Humoral andcellular immune response to elastin inpatients with systemic sclerosis. Autoimmunity. 1997; 25(4):233-241.  
23. Sato Y, Kataoka K, MatsumoriA, Sasayama S, Yamada T, Ito H, et al. Measuring serum aminoterminal typeIII procollagen peptide, 7S domain oftype IV collagen, and cardiac troponinT in patients with idiopathic dilatedcardiomyopathy and secondary cardiomyopathy. Heart. 1997 Nov;78(5):505-508. [PubMed].  
24. Kaiser WJ, Holbrook LM, Tucker KL, Stanley RG, Gibbins JM. Afunctional proteomic method for theenrichment of peripheral membraneproteins reveals the collagen bindingprotein Hsp47 is exposed on thesurface of activated human platelets. JProteome Res. 2009 Jun;8(6):2903-14.  
25. Ameye LG, Deberg M, OliveiraM, Labasse A, Aeschlimann JM, Henrotin Y. The chemical biomarkers C2C, Coll2-1, and Coll2-1NO2 providecomplementary information on type IIcollagen catabolism in healthy andosteoarthritic mice. Arthritis Rheum. 2007 Oct;56(10):3336-46. [PubMed].  
26. Rinaldi N, Willhauck M, Weis D, Brado B, Kern P, Lukoschek M, et al. Loss of collagen type IV in rheumatoidsynovia and cytokine effect on thecollagen type-IV gene expression infibroblast-like synoviocytes fromrheumatoid arthritis. Virchows Arch. 2001 Nov;439(5):675-82. [PubMed].  
27. Klein R, Klein BE, Moss SE, Davis MD, DeMets DL. The Wisconsinepidemiological study of diabeticretinopathy. II. Prevalence and risk ofdiabetic retinopathy when age atdiagnosis is less than 30 years. ArchOphthalmol. 1984 Apr;102(4):520-526.  
28. Brownlee M, Pongar S, CeramiA. Covalent attachment of solubleproteins by nonenzymaticallyglycosylated collagen. Role in the insitu formation of immune complexes. JExp Med. 1983 Nov 1;158(5):1739-1744.  
29. Brownlee M. Glycation productsand the pathogenesis of diabeticcomplications. Diabetes Care. 1992Dec; 15(12):1835-1843.  
30. Airaksinen KE, Salmela PI, Linnaluto MK, Ikaheimo MJ, Ahola K, Ryhanen LJ. Diminished arterialelasticity in diabetes: association withfluorescent advanced glycosylationend products in collagen. CardiovascRes. 1993 Jun;27(6): 942-945. [PubMed].  
31. Steiner G. Diabetes mellitus, dyslipoproteinaemias and atherosclerosis. Diabetologia. 1997 Jul; 40(Suppl. 2):S147-148. [PubMed].  
32. Peterszegi G, Mandet C, TexierS, Robert L, Bruneval P. Lymphocytesin human atherosclerotic plaque exhibitthe elastin-laminin receptor: potentialrole in atherogenesis. Atherosclerosis. 1997 Nov; 135(1):103 -107. [PubMed].  
33. Peterszegi G, Texier S, Robert L. Human helper and memorylymphocytes exhibit an inducibleelastin-laminin receptor. Int ArchAllergy Immunol. 1997 Nov;114(3):218-223.  
34. Tisheva S. Clinical importanceof immunological changes in elastinand collagen turnover in vessel wall inarterial hypertension. Dissertation foracquiring scientific-educationaldegree „Doctor“, 2004.  
35. Mekenyan E. Changes of elastinand collagen turnover in developmentof early cardiovascular complicationsin patients with metabolic syndrome. Dissertation for acquiring scientific-educational degree „Doctor“, 2012.