Прескочи към главното съдържание на страницата

Архив


БРОЙ 6 2017

Изследване на BRAF-мутации при болни с кожен меланом

виж като PDF
Текст A
Ина Кобакова, Емил Кънчев1, Дияна Камбурова1
Медицински университет „Проф. д-р Параскев Стоянов“, гр. Варна;  1Специализирана болница за активно лечение на онкологични заболявания „Д-р Марко Марков“, гр. Варна


През последните години се наблюдава значителен интерес към възможностите на диагностиката на кожния меланом посредством разнообразни имунохистохимични панели и с помощта на методи от молекулярната патология. Касае се за анализи на различни мутации, към които спада и мутацията BRAF, една серин-треонинпротеинова киназа от семейството на RAF-киназите. Представени са резултатите от изследването експресията на мутацията BRAF V600Е при 57 болни с кожен меланом в зависимост от възрастта и пола на пациентите и хистологичния подтип на тумора – суперфициално растящ меланом, lentigo maligna меланом, нодуларен меланом и акрален лентиго меланом.

Въведение

Кожният меланом е злокачествено новообразувание на меланоцитите. Честотата му нараства непрекъснато през последните години в световен мащаб, вкл. и у нас.

Молекулярната патология на кожния меланом се изследва много интензивно с разнообразни диагностични маркери. Една от най-честите мутации, свързани с развитието на различни неоплазии и най-вече на меланома, е BRAF V600. BRAF е серин/треонин киназа, която функционира в Ras-Raf-MEK-MAPK пътя. Този път нормално регулира клетъчната пролиферация и преживяване под контрола на растежни фактори и хормони[7].

Около 50% от меланомите притежават активираща мутация в BRAF. Най-разпространена от BRAF V600 мутациите е BRAF V600E, която прави киназата конститутивно активна, т.е. води до непрестанна пролиферация на туморните клетки. Тя е резултат от заместването на валина с глутамин (BRAF V600E) и представлява 70% от откритите BRAF мутации[2]. Следва мутацията BRAF V600K (след заместване с лизин) (при около 20% от случаите). Мутациите BRAF V600D и BRAF V600R се срещат по-рядко.


Материал и методи

Ние проучихме експресията на BRAF мутациите в биопсични материали от лезии, взети от 97 болни с кожен меланом. Пациентите са изследвани през периода между м. февруари 2012 г. и м. декември 2015 г. в УМБАЛ „Св. Марина“, гр. Варна, като са изпращани от УМБАЛ „Св. Марина“, гр. Варна, СБАЛОЗ „Д-р Марко Марков“ ЕООД, гр. Варна и други болнични заведения в България. Изследванията за BRAF V600E мутация са проведени в Лабораторията по молекулярна патология към Клиниката по обща и клинична патология при УМБАЛ „Св. Марина“, гр. Варна.

Обект на настоящото изследване са 57 болни на средна възраст от 57.58±14.32 год. (между 16 год. и 86 год.) с уточнена патохистологична характеристика на подтиповете на меланома. Касае се за 35 мъже на средна възраст от 58.69±13.36 год. (между 28 и 86 год.) и за 22 жени на средна възраст от 55.82±16.07 год. (между 16 и 82 год.). При останалите 40 болни тази идентификация липсва поради обективни причини, поради което те са изключени от проучването. Използват се FFPET-срезове от тумора с дебелина от 5 μm, поставени върху предметно стъкло и оцветени с хематоксилин-еозин. Тестът за мутацията BRAF V600Е се извършва с апарат Cobas® 4800 чрез полимеразно-верижна реакция в реално време по стандартизирана методика (CE-IVD). Използва се AmoyDx® BRAF V600 E/K/R/D китът за намиране на V600 E/K/R/D мутации – високочувствителен и селективен тест за намиране на мутациите в BRAF онкогена. Експресията на мутацията BRAF V600Е се отчита като положителна или отрицателна.


Резултати

Разпределението на изследваните бол­ни по пол и възраст (Фиг. 1) показва преобладаване на засегнатите лица във възрастовите групи между 51 и 60 год. (31.58%) и между 61 и 70 год. (22.81% от случаите). Ние установяваме положителна експресия на мутацията BRAF V600Е при 56.14%, а отрицателна – при останалите 43.86% от болните (Фиг. 2).

Фигура 1: Разпределение на изследваните болни по пол и възраст

Фигура 2: Разпределение на болните според броя на положителните и отрицателните BRAF мутации

Положителната експресия на мутацията BRAF V600Е преобладава при болните мъже на възраст до 60 год., а отрицателната – при тези на възраст между 61 год. и 80 год. (Фиг. 3). Положителната експресия на тази мутация е по-честа при болните жени на възраст между 31 год. и 50 год. и между 61 год. и 71 год., а отрицателната – при тези на възраст между 51 год. и 60 год. и между 71 год. и 80 год. (Фиг. 4).

Фигура 3: Възрастово разпределение на болните мъже според броя на положителните и отрицателните BRAF мутации

Фигура 4: Възрастово разпределение на болните жени според броя на положителните и отрицателните BRAF мутации

Най-често се диагностицира нодуларният подтип на кожния меланом – при 48 болни (28 мъже и 20 жени). Lentigo maligna меланом се открива при трима мъже и една жена, суперфициално растящият меланом – при трима мъже, а акралният лентиго меланом – при един мъж и една жена. Както се вижда на Фиг. 5 и Фиг. 6, преобладаването на положителната експресия на мутацията BRAF V600Е е особено отчетлива именно при нодуларния меланом, а отрицателната експресия е по-честа при акралния лентиго меланом и lentigo maligna меланом.

Фигура 5: Разпределение на болните мъже с положителни и отрицателни BRAF-мутации според подтипа на меланомате BRAF мутации

Фигура 6: Разпределение на болните жени с положителни и отрицателни BRAF мутации според подтипа на меланома

Обсъждане

Получените от нас резултати са подобни на тези, публикувани от съвременните чужди автори.

Положителна експресия на BRAF V600E се установява с помощта на количествена полимеразно-верижна реакция в реално време, специфична за BRAF V600E и BRAF V600K, при 39 от общо 82 болни с меланом (при 47.56% от случаите)[6].

Материали от 111 болни с меланом са изследвани по отношение на BRAFмутации, като при 89 случая са използвани следните четири метода: Sanger секвениране, пиросеквениране, полимеразно-верижна реакция в реално време и имунохистохимия[3].

Чувствителността на Sanger секвенирането на продуктите от полимеразно верижната реакция е 92.5% (между 78.5% и 98.0% при доверителен интервал от 95%), а чувствителността на специфичната за BRAF V600E полимеразно-верижна реакция в реално време – 97.5% (между 87.1% и 99.6% при доверителен интервал от 95%). Чувствителността на имунохистохимията с антитялото VE1, специфично за V600E, е 100% (между 91.2% и 100% при доверителен интервал от 95%), поради което то може да се използва като метод на първи избор. Пиросеквенирането е най-ефективният метод за откриване на BRAFмутации при кожния меланом и се препоръчва при отрицателно VE1 или при болни, които не може да се интерпретират.

Изследването на BRAF V600E мутации посредством пиросеквениране и имунохистохимия показва положителната им експресия спрямо антитялото VE1 при всички 26 болни с кожен меланом[13]. От друга страна, имунохистохимичните резултати по отношение на мутациите BRAF V600K и BRAF V600R са отрицателни.

Общо 100 болни с меланом в неоперабилен стадий IIIC или в стадий IV са изследвани за туморни BRAF мутации с помощта на конвенционални молекулярни техники за ДНК и имунохистохимично с новото специфично моноклонално антитяло VE1[8].

Чувствителността на антитялото за откриване на мутацията BRAF V600E е 97%, а специфичността – 98%. Методът е прецизен, бърз и икономически ефективен.

Директното Sanger секвениране установява положителна BRAF V600 мутация при 18 от 73 болни с меланом (при 24.66% от случаите)[5]. Всички мутации са положителни и за VE1. При 17 от тях се касае за V600E, а при една за V600K. При един друг болен е налице фалшиво-отрицателно VE1. Чувствителността на VE1 е 100%, а специфичността е 98%. Налице е отлично съвпадение между имунохистохимичния метод и директното Sanger секвениране (98.6%).

Мутацията в BRAF-V600 е доказана посредством пиросеквениране и имунохистохимия с антитялото VE1 при 75 от общо 96 меланома (при 78.12% от случаите)[14]. V600E е налице при 60 тумора, V600K при 10, V600R или V600M при два, а V600G при един тумор. Чувствителността на имунохистохимията е 93.3%, а специфичността е 97.2%.

Общо 102 болни с меланом са изследвани посредством циклично минисеквениране на ДНК и имунохистохимия със специфичното за BRAF V600E моноклонално антитяло VE1 в рамките на проспективно проучване[12]. Резултатите от двата теста са положителни за BRAF V600E мутация при 41 болни (при 40.20% от случаите). Чувствителността и специфичността на имунохистохимичния метод са съответно 100% и 96.8% при съпоставянето му с изследването на мутациите, основано на анализа на ДНК. С помощта на VE1 не се открива нито една от седемте мутации на BRAF V600K, но пък се установява една рядка мутация на BRAF V600E2.

При използването на антитялото BRAF VE1 при 93 меланома от хоспитализирани болни по отношение на мутацията BRAF V600E се постига чувствителност от 85% и специфичност от 100% на базата на съпоставка с данните от пиросеквенирането на ДНК[9]. От друга страна, липсва имунохистохимично оцветяване за VE1 при меланомите с мутациите BRAF V600K, BRAF V600Q и BRAF V600R.
Мутацията в BRAF-V600E е изследвана имунохистохимично посредством моноклоналното анти-BRAF антитяло при 41 болни с кожен меланом[10]. Положителна експресия се открива при 10 болни (при 24.39% от случаите).

Мутация в BRAF V600E се установява при 6 от 35 болни с кожен меланом (при 17.14% от случаите), изследвани с помощта на комбинирани техники за анализ на ДНК (алелно специфична полимеразно-верижна реакция и/или директно секвениране на ДНК), докато при 7 от тези болни (при 20% от случаите), изследвани чрез имунохистохимия, се открива положителна цитоплазмена експресия на анти-BRAF антитялото[4].

Първичните и метастатични лезии на 25 болни с меланом са изследвани за експресията на мутациите в BRAF V600E/Ec, V600K, V600D и V600R посредством полимеразно-верижна реакция RGQ за BRAF с кит Qiagen[1]. Разминаване между първичния и метастатичния тумор по отношение на статуса на BRAF се открива при 4 болни. При двама болни се касае за първични тумори, положителни за BRAF мутации и за метастатични тумори, отрицателни за тези мутации, а при други двама болни – за първични тумори, отрицателни за BRAF мутации и за метастатични тумори, положителни за тези мутации.

BRAF мутации се откриват при 154 от общо 250 болни с кожен меланом след терапевтична лимфаденектомия (при 61.60% от случаите) в хода на клинико-патологичното изследване през периода между 1995 г. и 2010 г.[11]. При 141 болни се касае за BRAF V600E, при 9 за BRAF V600K, и при 4 за други типове. Налице е корелация между положителната експресия на BRAF мутацията и по-младата възраст на болните. Проведеният молекулярен анализ показва, че статусът на BRAF мутациите при болните в стадий III на меланома не е прогностичен маркер при болните с макроскопски установено засягане на лимфните възли, но може да подпомогне вземането на решение за провеждане на адювантна терапия.

Препоръчва се изследването на BRAF му­тацията както при кожни меланоми в стадий IIIb и в стадий IV, така и при метастатични меланоми на базата на материала от метастазата, тъй като в нея е заложена последната туморна биология[2].

Резултатите от изследването на BRAF мутации са от решаващо значение при определяне на целесъобразността от провеждането на модерна прицелна терапия с инхибитори на BRAF при болните с кожен меланом.

     

  

 

   

книгопис:
1.    Bradish JR, Richey JD, Post KM, et al. Discordancy in BRAF mutations among primary and metastatic melanoma lesions: clinical implications for targeted therapy.- Mod. Pathol., 28, 2015, No 4, 480-486.
2.    Britten CD. PI3K and MEK inhibitor combinations: examining the evidence in selected tumor types. Cancer Chemother Pharmacol 2013; 71 (6): 1395-1409.
3.    Colomba E, Hélias-Rodzewicz Z, Von Deimling A, et al. Detection of BRAF p.V600E mutations in melanomas: comparison of four methods argues for sequential use of immunohistochemistry and pyrosequencing.- J. Mol. Diagn., 15, 2013, No 1, 94-100.
4.    Feller JK, Yang S, Mahalingam M. Immunohistochemistry with a mutation-specific monoclonal antibody as a screening tool for the BRAFV600E mutational status in primary cutaneous malignant melanoma.- Mod. Pathol., 26, 2013, No 3, 414-420.
5.    Huang WK, Kuo TT, Wu CE, et al. A comparison of immunohistochemical and molecular methods used for analyzing the BRAF V600E gene mutation in malignant melanoma in Taiwan.- Asia Pac. J. Clin. Oncol., 12, 2016, No 4, 403-408.
6.    Kristensen T, Clemmensen O, Hoejberg L. Low incidence of minor BRAF V600 mutation-positive subclones in primary and metastatic melanoma determined by sensitive and quantitative real-time PCR.- J. Mol. Diagn., 15, 2013, No 3, 355-361.
7.    Lazar AJ, Murphy GF. Melanoma. In: Robbins and Cotran Pathologic basis of disease. 9th ed. Kumar V, Abbas AK, Aster JC, eds. Philadelphia, Elsevier Saunders, 2015, 1147-1150.
8.    Long GV, Wilmott JS, Capper D, et al. Immunohistochemistry is highly sensitive and specific for the detection of V600E BRAF mutation in melanoma.- Am. J. Surg. Pathol., 37, 2013, No 1, 61-65.
9.    Pearlstein MV, Zedek DC, Ollila DW, et al. Validation of the VE1 immunostain for the BRAF V600E mutation in melanoma.- J. Cutan. Pathol., 41, 2014, No 9, 724-732.
10.    Qiu T, Lu H, Guo L, et al. Detection of BRAF mutation in Chinese tumor patients using a highly sensitive antibody immunohistochemistry assay.- Sci. Rep., 5, 2015, 9211. doi: 10.1038/srep09211.
11.    Rutkowski P, Gos A, Jurkowska M, et al. Molecular alterations in clinical stage III cutaneous melanoma: Correlation with clinicopathological features and patient outcome.- Oncol. Lett., 8, 2014, No 1, 47-54.
12.    Thiel A, Moza M, Kytölä S, et al. Prospective immunohistochemical analysis of BRAF V600E mutation in melanoma.- Hum. Pathol., 46, 2015, No 2, 169-175.
13.    Uguen A, Talagas M, Costa S, et al. NRAS (Q61R), BRAF (V600E) immunohistochemistry: a concomitant tool for mutation screening in melanomas.- Diagn. Pathol., 10, 2015, 121. doi: 10.1186/s13000-015-0359-0.
14.    Yaman B, Kandiloğlu G, Akalin T. BRAF-V600 mutation heterogeneity in primary and metastatic melanoma: a study with pyrosequencing and immunohistochemistry.- Am. J. Dermatopathol., 38, 2016, No 2, 113-120.