Прескочи към главното съдържание на страницата

Архив


БРОЙ 4 2018

Роля на поляризационната микроскоскопия за ревматологията

виж като PDF
Текст A
Станислава Попова, Мариела Генева, Анастас Баталов
Медицински университет, Пловдив, Факултет по медицина, Катедра по Пропедевтика на Вътрешни болести


Научната дейност не би съумяла да достигне днешните нива на развитие без съществуването на микроскопа. Поляризационната микроскопия има значителни преимущества пред другите микроскопски техники, защото позволява наблюдението на структури, които пречупвайки светлината по специфичен начин, дават допълнителна информация за съдържанието на тъканни проби и течности. Тя предоставя информация за състава и триизмерната структура на различни проби при болните с ревматологични заболявания. На практика, неограничавайки техния обхват, тази техниката разкрива информация за конкретното съдържание на кристалите, което е необходимо за диагнозата на кристалните артрипатии. Поляризационната микроскопия дава ценни насоки в научните изследвания, базирайки се на сравнително евтин и достъпен метод на изследване и предоставяйки информация, която не е достъпна с друга техника.

Научната дейност не би съумяла да достигне днешните нива на развитие без съществуването на микроскопа[1,2,3]. Микроскопът (от гръцки micros – малък, и skopeo – поглед) представлява оптична система от лещи, осигуряваща многократното увеличение на различни обекти. Първият микроскоп е създаден от Zacharius Yansen през 1595 г.[1,2,3].

Способността да се визуализира клетъчното съдържимо не може да се приеме за даденост до 1950 г. Въпреки че визуализацията на клетките и клетъчните органели има исторически напредък през вековете, началните изображения са със значение на артефакти и истинското им изучаване започва през средата на 20. век[4,5]. Първото научно доказателство за организация на клетъчни органели и включения е описано детайлно от Уолтър Шмид през 1937 г. със създаването на поляризационния микроскоп[6]. Този апарат използва оптичната анизотропия на прозрачните материали, за да разкрие детайлна информация за вътрешната структура на пробите. По-късно в университета Принстън в Ню Джърси, САЩ, Шайния Иноу създава подобрен поляризационен микроскоп, който може да визуализира слабо двойнопречупващи светлината структури[6].         

Поляризационната микроскопия има значителни преимущества пред флуоресцентната микроскопия, позволявайки наблюдението на структури, които пречупват светлината по специфичен начин и дават информация на съдържанието на човешките проби[6,7,8].

Микроскопът увеличава разделителната способност на окото – с лабораторния (светлинен) микроскоп тя е около 500 пъти увеличена, с електронния микроскоп – около 500 000 пъти. В зависимост от природата на лъчението, което се използва, се различават два вида микроскопи – светлинни (оптични) и електронни. При оптичните микроскопи се използва светлинен поток от видимата (ултравиолетова или инфрачервена) област на спектъра, а при електронните – поток от електрони. За човешкото око разделителната способност на микроскопа е от порядъка на 0.1 mm, с фотонния микроскоп тя достига 0.2 mm, т.е. 500 пъти повече, а с електронния микроскоп – 0.2 mm, или 500 000 пъти повече[7,8].

 
Видове микроскопи

Микроскопите са светлинни (оптични), електронни и сканиращи пробата микроскопи[9].

Съвременният светлинен микроскоп се състои от три системи – механична система (състои се от статив, предметна масичка, тубус/и, револверен механизъм, винтове), осветителна система (състои се от източник за осветяване на наблюдавания обект, кондензатор, бленди и филтри по пътя на светлината) и оптична система, която се състои от окуляри и оптични приспособления (лещи = корекционен индекс), които са между обекта и окуляра. Реализацията на принципната схема в микроскопа е следната: светлината от източника преминава през система от колекторни и кондензорни лещи с диафрагми, които осигуряват равномерното осветяване на всички точки от образеца. Това е от първостепенна важност, тъй като по такъв начин наблюдаваните разлики в изображението се дължат изцяло на образеца, а не на начина, по който той е осветен. Отразените (или преминалите) през образеца лъчи и част от тези, разсеяни от него, преминават през системата обектив-окуляр и проектират увеличен образ върху ретината на окото. В съвременните микроскопи лещите са системи от лещи, чрез които се компенсират хроматичната и сферична аберация и изкривявания[8,9].

Основните характеристики на микроскопа са:

  1. Увеличение
  2. Разделителна способност
  3. Контрастност

При дадена комбинация от обектив-окуляр общото увеличение се опре­деля от произведението на увеличенията им, всяко от които се получава от фокусното разстояние f на съответната леща по формулата M=f/(a-f), където "a" е разстоянието от обекта до равнината на лещата[9,10]. Оптималното общо увеличение на микроскопската система, в която участва определен обектив, трябва да бъде около 500 пъти числената му апертура, а максимално допустимото – около 1000 пъти. Колкото по-висока е числената апертура на обектива, толкова по-слабо трябва да бъде увеличението на окуляра. Поставянето на недопустимо силен окуляр влошава качеството на образа[10].

Контрастността е светлинната интензивност на фона към това на образеца. Плътни обекти върху прозрачен фон се разглеждат лесно в режим на преминаване или отражение. При тези режими се улавя възможно най-голяма част от преминалите или отразените лъчи и обектите се наблюдават тъмни върху светъл фон (режим на светло поле). Често обаче се налага разглеждането на почти прозрачни обекти върху прозрачен фон, например клетки или вградени обекти със същата прозрачност като околната среда. При такива обекти липсва амплитуден контраст и те се виждат трудно в режим на преминаване или отражение. Въпреки това при преминаване през образеца светлината дифрактира от границите на обекта и променя фазовата си разлика. При такива образци е необходимо фазовата разлика да се превърне в амплитудна. Това се прави с метода на фазово контрастна микроскопия, при който лъчът, преминал през образеца, интерферира с опорен лъч. Друг начин за наблюдаване на обекти с нисък контраст е те да са в режим на тъмно поле. В обичайния режим на светло поле се наблюдава преминалата или отразената светлина и дифрактиралите лъчи. В режим на тъмно поле се блокира преминалият/отразеният лъч и се наблюдават само дифрактиралите лъчи. Границите на обектите се виждат светли на тъмен фон, оттам и наименованието на метода. По такъв начин могат да се наблюдават обекти, дори по-малки от разделителната способност на микроскопа в режим на светло поле[10,11].

Някои обекти имат способност­та да променят поляризацията на светлината. За такива обекти е възможно постигането на висок контраст при поставянето на образеца между два поляризиращи елемента. При кръстосването на поляризиращия и анализиращия елемент се премахва преминалата светлина и преминава само светлина, чиято поляризация е променена от образеца[10,11,12].

Различаваме следните видове оптични микроскопи:

  • Фазовоконтрастен
  • Интерферентен
  • Поляризационен
  • Флуоресцентен
  • Конфокален и др.

Фазовоконтрастният микроскоп е създаден от Frits Zernike през 1936 г. Принципът на фазовоконтрастната микроскопия се състои в това, че скоростта и посоката на светлината се променя, когато преминава през среди с различен индекс на пречупване.

Получените различия във фазата с помощта на специална оптична система се трансформират в различия на интензитета на светлината, което води до получаването на съответния образ[11].

Интерферентният микроскоп представлява вариант на фазовоконтраст­ната микроскопия, при което е възможно количествено измерване на различията в плътността на изследвания обект[10,11].

Конфокалният сканиращ микроскоп е създаден през 1988 г. Той дава възможност да се установи точната локализация на някои клетъчни органели в живите клетки, като се наблюдават поредица от оптични срезове.

Поляризационният микроскоп се използва, когато е необходимо да се определи наличието и специфичните оптични качества на веществата, които имат свойството да пречупват двойно светлината[13,14]. Характерни за устройството му са поляризаторът, разположен под кондензатора (превръщаш преминаващата през него светлина в равнинно поляризирана) и анализаторът, разположен над обектива (с него се определя равнината на поляризация на светлината, излизаща от обекта). При кръстосани анализатор и поляризатор, зрителното поле е тъмно поради несъответствие между равнините на поляризация. На зрителното поле личат само тези двойно пречупващи светлинни обекти, чиято равнина на поляризация съвпада с равнината на анализатора. При употребата на компенсаторни механизми, различията в поляризацията се преобразуват в цветни разлики. В биологичните обекти оптично активни са тези вещества, които имат кристална или линейно периодична структура, например някои кристали, мембрани, колагенните влакна, течните кристали на мастните киселини и др.[13,14].

Поляризираната светлина е техника за повишаване на контраста, която подобрява качеството на изображението, получена с двурефлекторни материали, в сравнение с други техники, като осветяване на тъмно и светло поле, диференциален интерферентен контраст, фазов контраст, модулационен контраст на Хофман и флуоресценция. Микроскопите с поляризирана светлина имат висока степен на чувствителност и могат да бъдат използвани както за количествени, така и за качествени изследвания, насочени към широк спектър от анизотропни проби, каквато е синовиалната течност при болни с подагра, остеоартроза, псевдоподагра и ревматоиден артрит. Качествената поляризираща микроскопия е много популярна на практика, с многобройни томове, посветени на темата[13,14]. Обратно, количествените аспекти на поляризираната светлинна микроскопия, която се използва главно в кристалографията, представляват много по-трудна тема, която обикновено е ограничена до геолози, минералози и химици[15].

Поляризираният светлинен микроскоп е предназначен за наблюдаване и фотографиране на образци, които се виждат главно поради техния оптически анизотропен характер. За да изпълни тази задача, микроскопът трябва да бъде оборудван както с поляризатор, разположен в светлинния път преди образеца, така и с анализатор (втори поляризатор), поставен в оптичната пътека между обективния заден отвор и тръбите за наблюдение на камерата. Контрастът на изображението възниква от взаимодействието на равнината – поляризи­рана светлина с двуреактивен (или двойно-пречупващ) образец, за да се произведат два отделни компонента на вълната, които са поляризирани по взаимно перпендикулярни равнини. Скоростите на тези компоненти, които се наричат обикновени и извънредни вълнови прегради, са различни и варират в зависимост от посоката на разпространение на светлината[15,16]. След като излязат от пробата, светлинните компоненти стават фазови, но се рекомбинират с конструктивна и разрушителна интерференция, когато те преминават през анализатора. Тези концепции са очертани за полето на вълната, генерирано от хипотетичен двуреактивен образец[15,16].

Поляризираната светлинна микроскопия е в състояние да предостави информация за абсорбционния цвят и границите на оптичните пътеки между кристали с различни индекси на пречупване по начин, подобен на светлинното поле, но техниката може да разграничи изотропните от ани­зотропните вещества. Техниката за повишаване на контраста използва оптичните свойства, специфични за анизотропията, и разкрива подробна информация относно структурата и състава на материалите, които са безценни за идентификационни и диагностични цели при болните с ревматологични заболявания[15,16].

Изотропните материали, които включват разнообразие от газове, теч­ности, невтвърдени кубични кристали, демонстрират същите оптични свойства при изследване във всички посоки. Тези материали имат само един индекс на пречупване и никакво ограничение на посоката на вибрациите на светлината, преминаваща през тях. Обратно, анизотропните материали, които са 90% от всички твърди вещества, имат оптични свойства, които варират в зависимост от ориентацията на инцидентната светлина с кристалографските оси. Те показват диапазон от индекси на пречупване, които зависят както от посоката на разпространение на светлината през веществото, така и от координатите на вибрационната равнина. По-важното е, че анизотропните материали действат като струйни и разделят светлинните лъчи на две ортогонални компоненти. Техниката на поляризиращата микроскопия експлоатира смущенията на разделените светлинни лъчи, тъй като те отново се обединяват по една и съща оптична пътека, за да извлекат информация за анизотропни материали[1,6,15,16].    

Силните страни на поляризиращата микроскопия се илюстрират чрез изследване на конкретни тъканни материали и течности и свързаните с тях изображения. Поляризираната светлинна микроскопия се използва при диагностициране на подагра, псевдоподагра, амилоидни отлагания, изследване на мускулна тъкан, твърди и течни кристали, влакна, мазнини, всички които са част от съдържанието на синовиалната течност или ставите при болните с ревматологични заболявания.

Едно от най-често използваните приложения на микроскопията с поляризирана светлина е идентифицирането на кристали мононатриев урат при болни с подагра. Те представляват удължени призми, които имат отрицателен оптичен признак на брифрингенс, който генерира жълт интерферентен цвят, когато дългата ос на кристала е ориентирана успоредно на бавната ос на плаката за забавяне. Завъртането на кристалите през 90 градуса променя цвета им в синьо. Обратно, кристалите на псевдоподаграта (калциеви пирофосфатни кристали, имащи подобна форма) проявяват син цвят на интерференцията, когато са ориентирани успоредно на бавната ос на плаката за забавяне и жълт цвят, когато са перпендикулярни[17,18,19].

Поляризираната светлинна светлина осигурява информация за морфологията на големите влакна, цвета, плейo­хроматизма и индекса на пречупване на всички течности и структури на изследваните болни. Влакната, които са изотропни не се засягат от ротацията на поляризираната светлина, докато други включения (като мастни капки) показват плейохроматизъм[15,16].

В обобщение, поляризиращата микроскопия предоставя огромно количество информация за състава и триизмерната структура на различни тъканни проби при болните с ревматологични заболявания. На практика, неограничавайки техния обхват, тази техниката разкрива информация за конкретното съдържание на кристалите в изследваните проби, което е необходимо за диагноза на пациентите.

Поляризационната микроскопия дава ценни насоки в научните изследвания, базирайки се на сравнително евтин и достъпен метод на изследване и предоставяйки информация, която не е възможна с друга техника[5,12,19].

 

 
  
 
книгопис:
1.    lbert Van Helden, Sven Dupre, Rob Van Gent, “The Origins of the Telescope”, 2011, 28.
2.    David Whitehouse, Renaissance Genius,”Galileo Galilei and His Legacy to Modern Science”, 2009, 67.
3.    Albert Van Helden, Sven Dupre, Rob van Gent, Huib Zuidervaart, “The Origins of the Telescope”, KNAW Press, 2010, 24.
4.    Huib Zuidervaart, “The ‘true inventor’ of the telescope. A survey of 400 years of debate”, KNAW Press, 2012, 26-30.
5.    J.North, J. Roche, “The Light of Nature: Essays in the History and Philosophy of Science presented to A.C. Crombie”, Springer Science, Business Media, 2012, 202.
6.    Brainard H. and Stockman A., “Colorimetry. Handbook Of Optics, 3rd ed. Volume III: Vision And Vision Optics (eds. Bass M., Enoch J. M. and Lakshminarayanan V.)” 10.1–10.56 (McGraw-Hill, New York, 2010.
7.    Winchell N. And A. Winchel,”Elements Of Optical Mineralogy: An Introduction To Microscopic Petrography”,Wiley, New York, 1922.
8.    Oldenbourg R. and M. Shribak, “Microscopes. Handbook Of Optics, 3rd ed., Volume I: Geometrical And Physical Optics, Polarized Light, Components And Instruments (eds. Bass M. and Mahajan V. N.) 28.1–28.62.0.
9.    Oldenbourg R. and Shribak M., “ Microscopes. Handbook Of Optics, 3rd ed., Volume I: Geometrical And Physical Optics, Polarized Light, Components And Instruments (eds. Bass M. & Mahajan V. N.), 345.
10.    Born M. and E. Wolf, ”Principles of optics: Electromagnetic theory of propagation, interference and diffraction of light. 7th ed.”, Cambridge University, Cambridge, United Kingdom, 1999.
11.    Bennett H., “Methods applicable to the study of both fresh and fixed materials with polarized light,” in McClung’s Handbook of Microscopical Technique, Jones R. M., editor. , Ed., pp. 591–677, Paul B. Hoeber, New York: (1950)
12.    Wolman M., “Polarized light microscopy as a tool of diagnostic pathology,” J. Histochem. Cytochem. 23(1), 21–50 (1975).
13.    Ciampini MA, et al. Path-polarization hyperentangled and cluster states of photons on a chip. Light Sci Appl. 2016;5.
14.    Kenichi, I., Kokubun, Y. Encyclopedic Handbook of Integrated Optics. CRC Press (2005).
15.    Oldenbourg R, “Polarized light microscopy: principles and practice”, Send to Cold Spring Harb Protoc. 2013 Nov 1;2013 (11).
16.    Mehta S, Shribak M, R. Oldenbourg, “Polarized light imaging of birefringence and diattenuation at high resolution and high sensitivity”, J Opt. 2013 Sep 1;15(9).
17.    McCarty D.J., L. Hollander, “Identification of urate crystals in gouty synovial fluid”, Ann Intern Med. 1961;54:452–460.
18.    Dalbeth N., Merriman T.R., Stamp L.K., “Gout”, Lancet, 2016;388 (10055) : 2039–2052.
19.    Pascual E. F. Sivera, “Time required for disappearance of urate crystals from synovial fluid after successful hypouricaemic treatment relates to the duration of gout”, Ann Rheum Dis. 2007; 66 (8):1056–1058.