Прескочи към главното съдържание на страницата

Архив


БРОЙ 10 2019

Грип - Обща характеристика и вирусологична диагностика

виж като PDF
Текст A
д-р Анелия Гоцева1, доц. д-р Георги Попов2
1Лаборатория Вирусология, ВМА, гр. София;  2Катедра по инфекциозни болести, ВМА, гр. София


Грипът (Influenza, Flu, Grippe) е най-широко разпространеното инфекциозно заболяване в глобален мащаб, отличаващо се с уникален епидемичен и пандемичен потенциал. Ежегодно се регистрират сезонни епидемии, които водят до масова заболяемост, повишен брой амбулаторни прегледи и хоспитализации, обуславящи сериозни медицински и социално-икономически последици за общественото здраве. СЗО съобщава, че всяка година броят на смъртните случаи, вследствие на грипа и неговите усложнения е от 250 000-500 000.
 

Етиология

Грипните вируси (типове А, В, С и D) принадлежат към сем. Orthomyxoviridae и притежават сегментиран едноверижен РНК (ssRNA) геном с негативна полярност[29]. Имат размери от 80-120 nm, сферична форма и пет структурни белтъка (М, NР, Р, НА, NA), които участват във вирусната морфогенеза. Нуклео­капсидът им е със спирална симет­рия, а в сърцевината на вириона се намира ssRNA. Вирусният РНК полимеразен комплекс (RNP) се състои от три полимеразни протеини – РА, РВ1 и РВ2 (транскриптази). Хеликалният капсид е обвит от М1 матричен протеин и от двуслойна липидна обвивка (envelope), пронизана от повърхностните гликопротеини (gp) – хемаглутинин (НА) и невраминидаза (NA), както и М2 матриксния протеин[30] (Фиг. 1).

Фигура 1: Схематична структура на грипния вирус (ArsMedica)

 
НА е тример и изпълнява рецепторна функция, докато NA е тетрамер с ензимна функция. Грипните вируси А и В имат сходна структура и 8 генни фрагмента, всеки от които кодира един протеин, само 8 сегмент кодира два неструктурни белтъка (NS1, NS2). Грипен вирус С има 7 сегмента и само един повърхностен gp-HEF (hemagglutinin-esterase-fusion protein), който функционално съответства на НА и NA[3]. Важно структурно и функционално значение имат т.нар. мембранни (М, matrix) протеини, които са типовоспецифични антигени. М1 осигурява стабилността на вириона, докато М2 играе ролята на йонен канал. Според комбинацията на повърхностните протеини (HА, NА), грипните вируси А се разделят на подтипове[16]. Известни са 16НА (H1-H16) и 9NA (N1-N9) подтипа. Само три подтипа HA (H1, H2 и H3) и два NA (N1 и N2) са причинители на епидемии при хората[3]. Вирусите на грип B не се разделят допълнително на подтипове.

 
Епидемиология

Заболяването е известно от древността, но съвременните познания за грипа водят началото си от първата половина на ХХ-ти век, когато са открити грипните вируси А (W. Smith, C. Andrews, P. Laidlow, 1933) и В (J. Fransis, T. Magill, 1940). По-късно през 1949 г. R. Taylor идентифицира и третия тип грипен вирус – С. През 2011 г. от прасета е изолиран нов грипен вирус, който първоначално е считан за субтип на грипен вирус тип С. През 2016 г. той е класифициран като нов грипен вирус тип D.

Грипните вируси се различават по обхвата на гостоприемника и патогенността. Вирусите на грип A (различни подтипове) и грип B (генетични линии В/Victoria и B/Yamagata) циркулират повсеместно и обуславят ежегодни сезонни епидемии. През всеки грипен сезон доминира определен подтип А вирус или тип В вирус, като се наблюдава и ко-циркулация на субтипове грип A и грип В. Грип С се открива по-рядко и обикновено дава леки инфекции[27]. Грипен вирус тип D засяга предимно свине и говеда, като не са описани заболявания при хора.

Пандемиите се причиняват от най-разпространения и най-изменчив грипен вирус А, заразяващ хора, животни и птици. Дивите водни птици са естественият резервоар на инфлуенца А вирус (IAV)[21]. Сред многото подтипове циркулиращи вируси на тип А, три подтипа HA (H1, H2 и H3) и два NA (N1 и N2) са причинили епидемии при хората[3]. Influenza B virus циркулира сред хората и през няколко години причинява епидемии от респираторни заболявания[11]. Influenza C virus е рядко срещан при хората, но може да се изолира от свине. Към грип­ните вируси от тип А се отнасят т.нар. свински грип (H1N1) и птичи грип (H5N1), които са силно патогенни. От всички циркулиращи щамове най-масово разпространен е H1N1. Високопатогенният H5N1 предизвиква смъртоносни инфекции при хората[24], характеризиращи се с развитието на фулминантна пневмония и мултиорганна недостатъчност[4]. Вторичната бактериална пневмония е основна причина за смърт сред заразените[14]. След първите огнища на H5N1, свързани с птичия грип при домашните птици в Югоизточна Азия през 2003 г., трансмисията на H5N1 при хора с висока смъртност се наблюдава в 10 страни[28]. Генетичната характеристика на H5N1 вирусите открива мутации във вирусния полимеразен комплекс и прескачане на междувидовата бариера директно от птиците на хората. Освен това, наблюденията, сочещи потенциалната възможност за предаване на този вирус от човек на човек, мащабите на разпространение и тежестта на протичане, са сериозно предупреждение и поредно доказателство за това, че грипът е и ще продължава да бъде сериозен и актуален проблем за всяка национална здравна система. Пандемията през 1918 г. (т.нар. „испански грип”) е най-смъртоносната в историята на човечеството[22]. Тя е предизвикана от А(H1N1) с около 50 млн. жертви и най-голям брой заболели хора в активна възраст[9]. Характеристиката на този вирус показва, че неговото уникално съчетание от гени е отговорно за изключителната му вирулентност, като гените HA, NA и PB1 допринасят за високата му патогенност[25]. През 1957-1958 г. т.нар. Азиатски грип с причинител А(H2N2), появил се за първи път в Китай и Хонконгския А (H3N2) са „убили” общо 4.5 млн. човека. Размерът на епидемиите и пандемиите се определя от вирулентността на причинителя и нивото на колективния имунитет. Постинфекциозният имунитет е типовоспецифичен и краткотраен.

Най-забележителната характеристика на грипните вируси е уникалната им изменчивост, особено характерна за тип А, която се осъществява по два механизма: „антигенен дрейф” и „антигенен шифт”. Натрупването на точкови мутации води до поетапна модификация преди всичко в двата повърхностни антигена НА и NA, което може да доведе до промяна във вирулентността. Този механизъм е описан като „антигенен дрейф”.

„Антигенен шифт” отразява големите, резки антигенни промени, обуславящи появата на нов, пандемичен подтип. Пандемичен грип възниква, когато антигенното изместване (shift) генерира вирус, към който хората са възприемчиви, но имунологично наивни[3]. Наличието на сегментиран геном обуславя възможността за реасортация между животински (птичи) и човешки грипни вируси от тип А.

Основният механизъм на предаване на инфекцията е въздушно-капковият, посредством трансфер на респираторни секрети от инфектирани към възприемчиви индивиди, най-често при кихане, кашляне и говор. Малките капчици заразен аерозол са важен фактор в разпространението на инфекцията. Възприемчивостта към грипната инфекция е всеобща, контагиозният индекс е много висок (~100%). Боледуват хора от всички възрасти[27]. Сред най-уязвимите групи от населението са малките деца, бременните жени, хората над 65-годишна възраст, пребиваващите в организирани колективи, имуносупресирани и такива със съпътстващи хронични заболявания. Всяка година около 10% от възрастните и около 30% от децата се разболяват от грип. В страните с умерен климат ежегодните епидемии са със зимна сезонност[27]. Оценката на тежестта на грипните епидемии се извършва чрез проследяване на усложненията, главно бронхопневмониите и смъртните случаи по причина на грип.


Патогенеза

Епителът на трахеята, бронхите и белодробните алвеоли е първично място на вирусната репликация[22], която се извършва в клетъчното ядро с активното участие на трите вирус-специфични полимерази (РА, РВ1 и РВ2). За процесите на транскрипция и репликация на вирусния геном е отговорен вирусният РНК полимеразен комплекс. Репликативният цикъл е кратък (6-8 часа) и преминава през няколко етапа, като завършва с клетъчна смърт. Първоначалният етап включва вирусна адхезия и пенетрация чрез клатрин-медиирана рецепторна ендоцитоза. Основна роля има НА, който се свързва със специфичен клетъчен рецептор (α26-Gal) – остатъци на сиалова киселина с галактоза. Тази рецепторна специфичност е една от най-важните детерминанти, които влияят върху тропизма на гостоприемника, включително междувидовата адаптация и транс­мисия[19]. За инфекциозност­та на грипния вирус е от значение разцепването на НА от клетъчните протеази на две субединици – функционалните протеини HA1 и HA2[10]. Аминокиселинната последователност на мястото на разцепване определя органния тропизъм. И двата повърхностни gp (НА, NA) взаимодействат със сиаловата киселина (SA)[12]. Подкисляването на ендозома води до конформационни промени в НА, при което се инициира фузия с ендозомалната мембрана. Същевременно се активира М2 йонният канал с разкъсване на междупротонните връзки, последващо освобождаване на рибонуклеопротеиновия комплекс и транспортирането му в ядрото на клетката[17].

Процесът на транс­крипция се осъществява с участието на РНК-зависима РНК-полимераза (Р). В началото на инфекцията се синтезират NS и NP, в късните фази – М, НА, NP, докато Р се синтезира по време на целия репликативен цикъл. Сглобяването на вируса, размножаването и раздробяването се координират в липидните салове на клетъчната плазмена мембрана[18]. С участието на NA новообразуваните вириони се освобождават чрез пъпкуване през цитоплазмените мембрани, способни да инфектират други клетки. В резултат от размножаването на грипните вируси в епителните клетки на дихателните пътища настъпва клетъчен лизис и излющване на респираторния епител. Възпалителните промени са катарално-хеморагично-некротични. Характерно е честото десцендиране на процеса от горните към долните дихателни пътища с последваща виремия и органна локализация. Основните патофизиологични промени са имуносупресия и обща интоксикация, резултат от освободените медиатори (цитокини) и токсични субстанции. В определени случаи мощният имунен отговор може да предизвика „цитокинова буря”. Грип­ните вируси улесняват бактериалното колонизиране на дихателните пътища, като вирусната невраминидаза повишава бактериалната адхезия към респираторния епител. Наблюдава се вирус-индуцирана повишена експресия на цитокини[13]. Вирусобусловената цитокинова дисрегулация може да допринесе за тежестта на заболяването[20]. Патогенезата на грипната инфекция е медиирана от различни фактори, сред които важно значение има имунният отговор на организма, включително вроденият и придобит имунитет.


Клинично протичане и усложнения

Инкубационният период на грипа е кратък (1-3 дни). В преобладаващата част от случаите грипът е остро, самоограничаващо се заболяване (неусложнен грип), което завършва с оздравяване за около 7 дни[27]. Началото е остро, внезапно, като водещи клинични синдроми са токсико-инфекциозният и катаралният. Характерно е първоначалното рязко повишаване на температурата до 39-40◦С, с втрисане. Болните съобщават за главоболие, общо неразположение, отпадналост, миалгии, артралгии, болки в гърлото, суха дразнеща каш­лица и хрема. Кашлица и адинамия могат да персистират две и повече седмици. При децата по-често се съобщава за гадене, повръщане и диариен синдром. Фебрилни гърчове се наблюдават при 6-20% от хоспитализираните деца с грип. В протичането на грипа се наблюдават от леки до много тежки, включително фулминантни форми с развитие на токсиинфекциозен шок, ДВСК и неблагоприятен изход. По правило по-тежко е клиничното протичане при т.нар. рискови контингенти от населението – кърмачета и малки деца, бременни, имуносупресирани, хора в напреднала възраст и със съпътстващи хронични заболявания.

Смъртните случаи обикновено са свързани с развитието на сериозни усложнения, като най-често регистрираните са от страна на дихателната система – пневмонии (първична грипна и вторична бактериална), ларинготрахеобронхити, среден отит (при деца), синуити. Грипният вирус се размножава в епитела на дихателните пътища по цялото им протежение, понякога със значителна десквамация на епитела на бронхите и интерстициални изменения в белите дробове. Увреждането на респираторния тракт под формата на вирусно индуцирана некроза, имунно медиирана апоптоза или други форми на клетъчна смърт води до ARDS (Acute Respiratory Distress Syndrome). Хората с хронични пулмо- и кардиопатии или със захарен диабет са изложени на по-висок риск от развитие на тежки и животозастрашаващи усложнения. Хеморагичният бронхит и пневмония могат да се развият в рамките на часове[22] (Фиг. 2).

Фигура 2: Некротичен трахеобронхит и хеморагична пневмония при грип (Zdrave-Bg.eu))

 
Първичната грипна пневмония може да протече тежко с развитие на ОДН, а в определени случаи и фатално. Хистологично се откриват малки тромбози на съдовете, интерстициален оток и възпалителни инфилтрати, кръвоизливи и дифузно алвеоларно увреждане в допълнение към некротизиращия бронхит и бронхиолит[22]. Най-често срещаният бактериален изолат при грипна пневмония е Staphylococcus aureus[15]. У деца, особено до едногодишна възраст, възможно усложнение е грипозният круп, който се проявява с лаеща кашлица и инспираторна дисп­нея.

Често усложнение при тях е и възпалението на средното ухо. Субективните оплаквания при грипния отит включват силна болка в ухото, фебрилитет до 40◦С, главоболие и намаление на слуха. Обективно при отоскопия се наблюдава хиперемирана и инфилтрирана мембрана, с малки хеморагични мехурчета по нея. Спонтанната перфорация настъпва рано. При неблагоприятна еволюция могат да се развият лабиринтоневрити с последваща глухота и менингит. Засягането на нервната система при грип може се прояви с енцефалопатия (главно в детска възраст) с мозъчен оток, серозен менингоенцефалит, енцефаломиелит, моно- и полиневрити, Guillain-Barre синдром.

Полирадикулоневритът тип Гилен-Баре се разгръща прогресивно за няколко седмици и се характеризира със симетрични вяли парализи, сетивно-двигателни разстройства и белтъчно-клетъчна дисоциация в ликвора още от първите дни на заболяването.

Усложненията от страна на сърдечно-съдовата система (миоперикардити) се наблюдават предимно при възрастни хора[26]. Редки усложнения могат да бъдат миозит и синдром на Reye при деца, приемали салицилати, който е с лоша прогноза и висок леталитет. При лица с коморбидитет грипната инфекция може да предизвика обостряне на хронични заболявания като сърдечна недо­статъчност, бронхиална астма и диабет.

Грипният вирус е сред изолираните вирусни агенти, особено през зимните екзацербации на астма. Грипът влошава диабетния контрол, като води до хипергликемия и задълбочава недостига на инсулин, което повишава риска от развитие на остри метаболитни усложнения.


Лабораторна диагностика на грипа

По-голямата част от случаите на човешки грип са клинично диагностицирани при обявена грипна епидемия. Трябва обаче да се има предвид, че инфекцията с други респираторни вируси, като напр. RSV, параинфлуенца и аденовирус също могат да наподобят грипоподобно заболяване (ILI), което затруднява клиничното разграничаване на грипа от други патогени[27]. За прецизната вирусологична диагностика е от съществено значение преданалитичният етап на лабораторния процес, включващ събиране на подходящи проби.

Грипният вирус проявява подчертан тропизъм към респираторния епител, поради което най-предпочитани са проби от дихателната система, съдържащи епителни клетки (назален и НФС или смив, БАЛ, трахеален аспират), които е най-добре да бъдат взети до 3-ия ден от началото на заболяването. Правилното вземане, съхранение и транспортиране на клинични проби за изследване е първата стъпка в лабораторния диагностичен процес. Пробите от ГДП се вземат с тампон от дакрон или коприна с пластмасова дръжка и се поставят (размиват) във вирусна транспортна среда. Тампони от друга материя (памук) и дървена дръжка не се използват, защото могат да съдържат субстанции, инактивиращи вируса. Взетите материали се доставят до лабораторията във възможно най-кратък срок, като се транспортират при хладилни условия.

За поставянето на етиологична диагноза съществува широк набор от диагностични тестове[6]. СЗО публикува и актуализира различни насоки относно лабораторните техники. Използваните методи за доказване на грипни вируси включват: директна детекция на антиген, вирусна изолация, установяване на специфични антитела и откриване на грип-специфична РНК. В клинични условия широко приложение намират експресните имунохроматографски тестове (rapid test, RIDT) за откриване на вирусен антиген в респираторни проби, които са бързи, удобни, лесни за изпълнение, но с по-ниска чувствителност в сравнение с PCR базираните техники. Те имат висока специфичност, а чувствителността им може да бъде сравнена с тази на имунофлуоресцентните (IFА) и имуносорбентните анализи (EIA)[1]. Те разграничават грип А от грип В.

Доказано е, че диагностицирането на грипа чрез бързи тестове ограничава антибиотичната употреба[2]. Изолацията на грипен вирус се приема за „златен стандарт” в диагностиката, но е трудоемък и бавен метод, поради което не се използва в рутинната лабораторна практика, а единствено в референтни лаборатории. Чувствителни биологични модели за грипни вируси са КЕ (размножават се в епителните клетки на ембрионалните обвивки), клетъчни култури (MDCK – от кучешки бъбрек) и африкански порчета.

Грипният вирус е бил изолиран за първи път през 1933 г. на 10-12–дневни кокоши ембриони (КЕ). Чувствителността и специфичността на всеки тест за грипни вируси може да варира в зависимост от използвания метод и диагностичен тест, времето от началото на заболяването до вземането на качествена проба за изследване и стриктното спазване на работната процедура. Както при всеки лабораторен тест, резултатите трябва да се оценяват в контекста на наличните клинико-епидемиологични данни.

Американското общество по инфекциозни болести (IDSA) препоръчва използването на бързи диагностични тестове за откриване на грипни вируси в респираторни проби на амбулаторни пациенти и използването на молекулярни анализи (RT-PCR) при хоспитализирани пациенти[23].

Серологичните тестове се основават на установяването на специфични за грипа антитела (IgM/IgG), които се появяват две седмици след първоначална инфекция, поради което не могат да дадат своевременни резултати, подпомагащи взимането на терапевтични решения. Те са от значение преди всичко за епидемиологични проучвания, поради което са показани за ретроспективна диагностика[8]. Молекулярните методи (PCR, Polymerase Chain Reaction) се считат за най-чувствителни и специфични в лабораторната диагностиката на грипа и заместват вирусната изолация като референтен стандарт[5]. Позволяват откриване на грипни вируси в респираторни проби, типиране и субтипиране. Недостатък е високата им цена и скъпоструващо оборудване.


Терапия и профилактика

Етиологичната терапия се провежда с две групи противогрипни препарати M2-инхибитори и невраминидазни инхибитори (NAIs). Към първата група се отнасят Аmantidin и Remаntadin, а към втората група Оseltamivir и Zanamivir. Те действат специфично само на грипните вируси, като повлияват избирателно отделни фази от вирусния репликативен цикъл. Лечението трябва да бъде започнато максимално рано, още в първите 24-48 часа от началото на заболяването поради по-широкия антивирусен спектър (А/В), по-добрата поносимост и по-малък потенциал за поява на резистентност. NAIs понастоящем се използват като основно терапевтично средство[7]. Важно място в лечението на грипа заема патогенетичната и симптоматична терапия. Специфичната профилактика на грипа се провежда с ваксини (три- или четирикомпонентни).

Ваксинацията е най-сигурното средство за превенция и контрол на грипа. Надзорът на заболяването в световен мащаб се осъществява от СЗО и се изразява в проследяване циркулацията на грипни вируси с обмяна на епидемиологична информация и даване на препоръки за профилактика и лечение. Съществуващите начини за профилактика на грипа включват ежегодна ваксинация и прием на противовирусни средства за химиопрофилактика и терапия в съответния дозов режим, чието приложение засилва ефекта от ваксината.


Заключение

Грипните вируси са значими човешки респираторни патогени с уникален епидемичен/пандемичен потенциал, поради което представляват сериозна заплаха за човешкото здраве. Тежестта на индуцираното от тях заболяване е функция от взаимодействието между вируса и имунния отговор на организма. Дългогодишните наблюдения сочат, че грипът е най-широко разпространеното инфекциозно заболяване в глобален мащаб и заема първо място в структурата на ОРЗ. Всяка година броят на заразените съставлява около 1/10 от световното население, а регистрираните случаи на заболели от грип обхваща 1/3 от всички случаи с временна нетрудоспособност. Грипът крие сериозен риск от усложнения особено сред високорисковите контингенти и подценяването му може да има неблагоприятни последици за здравето.

 

 

 

 
книгопис:
1.    Booth S, Baleriola C, Rawlinson WD. Comparison of two rapid influenza A/B test kits with reference methods showing high specificity and sensitivity for influenza A infection. J Med Virol. 2006;78:619–622.
2.    Bonner AB, Monroe KW, Talley LI et al. Impact of the rapid diagnosis of influenza on physician decision-making and patient management in the pediatric emergency department: results of a randomized, prospective, controlled trial,Pediatrics, 2003, vol.112 (pg. 363-7).
3.    Bouvier NM, Palese P. The biology of influenza viruses Vaccine. 2008 Sep 12;26 Suppl 4:D49-53.
4.    Chotpitayasunondh T, et al. Human disease from influenza A (H5N1), Thailand, 2004. Emerg. Infect. Dis. 2005;11:201–209.
5.    Cox NJ, Zeigler T. Murray PR et al.Influenza viruses,Manual of clinical microbiology. 8th ed, 2003 Washington, DC American Society for Microbiology Press (pg.1360-7).  
6.    George KS. Diagnosis of influenza virus. Methods Mol Biol. 2012;865:53-69. doi: 10.1007/978-1-61779-621-04.
7.    Gubareva LV, Kaiser L, Hayden FG. Influenza virus neuraminidase inhibitors. Lancet. 2000 Mar 4;355(9206):827-35.
8.    Hayden FG, Palese P. Richman DD et al. Influenza viruses, Clinical virology. 2nd ed, 2002 Washington, DC American Society for Microbiology Press.
9.    Johnson NP, Mueller J. Updating the accounts: global mortality of the 1918–1920 “Spanish” influenza pandemic. Bull. Hist. Med. 2002;76:105–15.
10.    Klenk HD, Garten W. Host cell proteases controlling virus pathogenicity. Trends in Microbiology. 1994;2:39–43.
11.    Koutsakos M, Nguyen TH, Barclay WS, et al. Knowns and unknouns of Influenza B viruses. Future Microbiol.2016;11(1):119-135.
12.    Matrosovich M., Herrler G., Klenk H.D. Sialic acid receptors of viruses. Top. Curr. Chem. 2015;367:1–28.
13.    Mina M., Klugman K. The role of influenza in the severity and transmission of respiratory bacteraial disease. Lancet Respir Med 2014; 2: 750-63.
14.    Morens DM, Taubenberger JK, Fauci AS. Predominant role of bacterial pneumonia as a cause of death in pandemic influenza: Implications for pandemic influenza preparedness. Journal of Infectious Diseases. 2008;198:962–970.
15.    Oliveira EC, Marik PE, Colice G. Influenza pneumonia: a descriptive study. Chest. 2001;119:1717–1723.
16.    Palese P, Shaw ML. Orthomyxoviridae: The Viruses and their Replication. In: Knipe DM, Howley PM, editors. Fields Virology. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; 2007.
17.    Pinto LH, Lamb RA. The M2 proton channels of influenza A and B viruses. J Biol Chem 2006; 281: 8997–9000.
18.    Rossman JS, Lamb RA. Influenza virus assembly and budding. Virology 2011;411:229-236.
19.    Russell C.J., Hu M., Okda F.A. Influenza hemagglutinin protein stability, activation, and pandemic risk. Trends Microbiol. 2018;26:841–853. doi: 10.1016/j.tim.2018.03.005.
20.    Seo SH, Hoffmann E, Webster RG. Lethal H5N1 influenza viruses escape host anti-viral cytokine responses. Nat. Med. 2002;8:950–954.
21.    Shinya K, Makino A, Kawaoka Y. Emerging and reemerging influenza virus infections. Vet Pathol. 2010;47:53–57.
22.    Taubenberger JK, Morens DM.The Pathology of Influenza Virus Infections. Annu Rev Pathol. 2008;3: 499–522.
23.    Timothy M Uyeki, Henry H Bernstein, John S Bradley еt al. Clinical Infectious Diseases, Volume 68, Issue 6, 15 March 2019, Pages e1–e47.
24.    Tran TH, et al. Avian influenza A (H5N1) in 10 patients in Vietnam. N. Engl. J. Med. 2004;350:1179–1188.
25.    Tumpey TM, Basler CF, Aguilar PV, Zeng H, Solorzano A, Swayne DE, et al. Characterization of the reconstructed 1918 Spanish influenza pandemic virus. Science. 2005 Oct 7; 310 (5745):77–80.
26.    Webster RG, Govorkova EA. Continuing challenges in influenza. Ann N Y Acad Sci, 2014, 1323(1), 115-139.
27.    WHO . 2018 Influenza (Seasonal) Fact Sheet. WHO; Geneva, Switzerland: 2018.
28.    World Health Organization: Avian Influenza. www.who.int/csr/ disease/avian_ influenza/ en/ index.html.
29.    Wright PFNG, Kawaoka Y. Orthomyxoviruses. Fields Virology. 2007:1691–1740.
30.    Wright PF, Webster RG. Orthomyxoviruses. In: Fields BN, Knipe DM, Howley PM, et al.,editors. Fields Virology. 4th ed. Philadelphia: Lippincott Williams and Wilkins; 2001. p. 1533.