Прескочи към главното съдържание на страницата

Архив


БРОЙ 1 2021

Биомаркерите трасират персонализирания подход при пациентите с хематологични заболявания

виж като PDF
Текст A
Милан Ягуриноски, Милена Стойчов-Ягуриноска, Бранимир Спасов
Национална специализирана болница за активно лечение на хематологични заболявания, София


Туморните биомаркери пре­д­ста­вля­ват биологични мо­ле­ку­­ли, продуцирани или от туморни клетки, или от човешки тъкани в отговор на неоплазия, които могат да бъдат обективно измерени и оценени като индикатори на туморния процес в организма. Същите те могат да бъдат с предиктивна и про­гностична стойност[1].
Молекулярното тестване има широка приложимост в хематопато­логията за потвърждаване на диа­гноза, субкласификация, определяне на прогноза и измерима резидуална болест.

Диагностични и предиктивни биомаркери при миело­пролиферативни неоплазии

BCR-ABL фузионен ген при хрони­чна миелоидна левкемия
ХМЛ е миелопролиферативна нео­плазия (МПН), характеризираща се с хромозомната транслокация t(9;22)(q34.1; q11.2), която води до синтеза на BCR-ABL1 ген и образуване на филаделфийската хромозома (Ph*), в резултат на което настъпва про­лиферация на гранулоцитния ред с увеличаване на гранулоцитите в кръвта и на ми­е­лоидните пре­курсори в костния мозък[2]. Детекцията на Ph* се из­вър­шва чрез цитогенетика, флуоресцентна in situ хибридизация (FISH) или полимеразно-верижна реакция след обра­тна транскрипция (RT-PCR), която се използва и за измерване на минималната резидуална болест. Пациентите с ХМЛ получават тирозин-киназен инхибитор (ТКИ) Imatinib като първа линия терапия съгласно данните от международно проучване IRIS[3]. Отговорът към терапията може да бъде класифициран като пълен хематологичен, пъ­лен цитогенетичен и молекулярен отговор (МО) въз основа на RT-PCR. Голям МО се определя като редукция с 3-log в сравнение с изходното ниво (или ≤0.1%), а пълният МО – като намаляване с ≥4.5-log от изходното ниво (или ≤0.0032% )[3]. Липсата на MO означава, че най-вероятно има придобита резистентност към ТКИ и търсенето на BCR-ABL1 мутации остава основен подход, който ръководи избора на терапията с последваща генерация ТКИ при тези пациенти.

JAK-2, CALR и MPL-мутации при полицитемия вера, есенциална тро­м­­боцитемия и първична миелофи­броза
Ph-негативните МПН в това чи­сло полицитемия вера (ПВ), eсен­циалната тромбоцитемия (ЕТ) и първичната миелофиброза (ПМФ) представляват клонални нарушения на хематопоезата, характеризиращи се с високи нива на генетични промени и нарастваща предразположеност към трансформация в остра миелоидна левкемия (ОМЛ)[2].

Januse kinase 2 (JAK2) генът има ключова роля в сигналната трансдукция. Мутацията JAK2 V617F е доказана в 95% от пациентите с ПВ, в около 50-65% с ЕТ и ПМФ, както и при 1/2 от пациентите с рефрактерна анемия с ринг-сидеробласти, асоциирана с изразена тромбоцитоза. При останалите 5% с ПВ, при които не се открива мутация JAK2 V617F, се откриват мутации в екзон 12 на JAK2 гена[2]. По същия начин, при пациенти с ЕТ и ПМФ без мутация JAK2 V617F, е показана оценка на myeloproliferative leukemia virus oncogene (MPL).

Освен мутациите в JAK2 и MPL гените, при 20-25% от случаите с ЕТ и ПМФ се идентифицират мутации в гена calreticulin (CALR), включващи инсерции (ins) и делеции (del). През последните години за едновременен скрининг и на трите мутации се предлага NGS[4-6].

Терапевтичната стратегия варира при отделните болни и се определя от рисковата група и наличието на симптоматика. При асимптомни пациенти не се налага лечение, докато при симптоматични пациенти с ПМФ приложение намира таргетната терапия с JAK1/2-инхибитора Ruxolitinib, както и някои нови експериментални молекули (Табл. 1).

Диагностични и предиктивни биомаркери при миелодиспластичен синдром
Миелодиспластичният синдром (МДС) е клонално заболяване на хемо­поетичната стволова клетка, харак­теризиращо се с морфологична дис­плазия и неефективна хемопоеза, проявяващо се с периферна цитопения[2]. Различни цитогенетични аномалии (ЦГА) се считат за предполага­емо доказателство за МДС дори при липса на морфологична дисплазия (т.е.-5/del[5q],-7/del[7q], +8, Y, del[20q], [i][17q],-13/del[13q], del[11q], del[12p], del[9q], [idic][Xq13] и някои балансирани транслокации включващи хромозомите 1, 2, 3, 9, 11, 16 и 21)[2].

Използват се раз­лични прогно­стични модели при МДС. Най-широко възприета е международната про­гностична скоринг система (IPSS) и нейната ревизирана версия (IPSS-R), като и двете включват процент бласти в костния мозък, ЦГА и брой цитопении. За разлика от ЦГА, които се наблюдават в 1/2 от случаите, в повечето случаи на МДС се открива най-малко една „driver“ мутация. Различни епигенетични модификатори (вкл. хистонови модификатори TET2, IDH1/2, DNMT3A, EZH2, ASXL1, SF3B1, U2AF1, SRSF2 и ZRSR2), гени на транс­крипционен фактор и киназа сигнални гени са замесени при МДС, което дава основания за прилагане на вече одобрени или в процес на разработка и проучвания таргетни терапии.

Хипометилиращите агенти (ХMA) Azacitidin и Decitabin се използват като първа линия терапия при пациенти с висок риск, с цел постигане на ремисия, намаляване на трансфузионната зависимост или като бридж към алогенна трансплантация на стволови клетки (АСКТ). Въпреки това в 1/2 от пациентите се наблюдава ре­зистентност към терапията и прогресия към ОМЛ. Понастоящем има възможност за прилагане на таргетна терапия при пациентите с МДС, като BCL2 инхибитора (Venetoclax) и checkpoint инхибитори като монотерапия или в комбинация с ХMA като втора линия[7,8].

Диагностични и предиктивни био­маркери при остра миелоидна лев­кемия
ОМЛ са хетерогенна група от хемaтологични неоплазии, характеризиращи се с клонална експанзия от миелоидни бласти в костния мозък, периферната кръв и други тъкани[2].
Резултатите от многобройни клинични изпитвания през последните десетилетия показват, че общата преживяемост (ОП) достига до 11.5 години при пациентите с благоприятен и по-малко от 1 година при пациенти с неблагоприятен риск.

Групата с благоприятен риск (5-годишна ОП 50-80%) включва пациенти с t(15;17), t(8;21), inv(16)/t(16;16), нор­­ма­­лен кариотип и мутирал nucle­ophosmin (NPM1)-ген или нормален кариотип с CCAAT/enhancer binding protein α (CEBPA) биалелна мутация.

Пациентите с неблагоприятен риск (5-годишна ОП, 5-20%), включително тези с MLL аберации, inv(3)/t(3;3), t(6;9), -7/del(7q), -5/del(5q), del в TP53 и комплексен кариотип, са подходящи за АСКТ след стандартна индукция по протокол „7+3“[2].

Биомаркерите са важни за субкласификацията на ОМЛ, като са определени няколко категории, въз основа на наличието или отсъствието са­мо на повтарящи се ЦГА, по-спе­циално t(8;21)(q22;q22), inv(16), t(15;17)(q22;q12), t(9;11)(p22;q23), t(6;9)(p23;q34), inv(3) и t(1;22)(p13;q13). В ня­кои случаи само наличието на едно от тези отклонения е достатъчно за поставяне на диагноза, дори при липса на конвенционалните критерии за >20% бласти в костния мозък и/или периферната кръв, като в случая на ОМЛ с t(15;17) или аберации, въвличащи core-binding factor (CbF). Рутинният подход за откриване на тези транслокации включва конвенционална цитогенетика, FISH и NGS.
Друг пример за молекулярен биомаркер, който може да подпомогне терапевтичното модулиране, е детекцията на cluster of differentiation 117 (C-kit) при CbF-ОМЛ. Мутациите на C-kit обаче отменят благоприятната прогноза, която обикновено е характерна за тази подгрупа пациенти с ОМЛ.

FLT3-вътрешна тандемна дупликация
Аберациите на Fms Like Tyrosine ki­na­se 3 (FLT3) се наблюдават при 5-10% от пациентите с ОМЛ. Инхибиторите на FLT3 представляват нова терапевтична възможност за пациенти в тази категория. Инхибиторите на FLT3 от клас I (Midostaurin) или II (Gilteritinib, Quizartinib) се използват като терапия от първа линия, както и при последващ рецидив. В ход са клинични проучвания за нови молекули (Табл. 1). Midostaurin в комбинация с конвенционалната химиотерапия има положителен ефект върху всички рискови групи, групирани по ELN[9]. Проучванията показват, че FLT3 инхибиторите от второ поколение в комбинация с „7+3“ при рефрактерни пациенти водят до подобряване на честотата на пълен отговор (48% срещу 27%) и по-продължителна ОП (6.2 месеца срещу 4.7 месеца). Засега е под въпрос дали ефектът на инхибиторите персистира и при поддържащото лечение, въпреки че първоначалните резултати от проучванията са положителни[10].

NPM1-мутация
Мутациите на NPM1-гена най-често се откриват чрез PCR. NPM1-мутиралата ОМЛ е самостоятелна подгрупа в класифик­ацията на Световната здравна организация (СЗО) 2016 г. и се свързва с уникални морфологични характе­ристики (бласти с „подобни на ча­ша – cup-like“ ядра), благоприятна про­гноза и нормален кариотип[2].

Биалелна CEBPA мутация
Пацие­н­тите с мутирал CEBPA ген пока­зват резултати подобни на тези в благоприятната цитогенетична подгрупа на ОМЛ. Прогностичната стойност на CEBPA е в двойно мутиралата подгрупа пациенти, при които липсват мутации FLT3 и NPM1.

PML-RARA-фузионни транскрипти
Установяването на t(15;17)(q22;q21) е диагностично за остра промиелоцитна левкемия. Фузионният ген PML-RARA се образува при реципрочен обмен на генетичен материал при t(15;17)(q22;q21)[2].

Лечението с All TransRetinoic Acid (ATRA) дава възможност за диферен­циация и в комбинация с химиотерапия може да доведе до пълна ре­ми­сия в значителна част от пациентите. Вариантните транслокации, включващи RARA се наблюдават в <2% от случаите, но те са важни като се има предвид, че някои пациенти проявяват резистентност към лечението с ATRA.

Диагностични и предиктивни биомаркери при остра лимфобластна левкемия
Острите лимфобластни левкемии (ОЛЛ) представляват клонални нарушения на хемопоетичните прогениторни клетки, при които са налице отклонения в лимфоидната клетъчна диференциация и пролиферация, в резултат на които настъпва инфилтрация на лимфобласти в костния мозък и/или други органи и тъкани[2].

Остра B-клетъчна лимфобластна левкемия
Подобно на ОМЛ, откриването на някои характерни транслокации допълнително субкласифицира пациентите с B-ОЛЛ, включително t(12;21) (p12,q22) TEL/AML-1, t(1;19) (q23;p13) PBX/E2A, t(9;22) (q34;q11) ABL/BCR, t(5;14) (q31;q32) IL3/IGH и (V;11) (V;q23) V/MLL[2].

При 25% от възрастните и 2-4% от децата се открива t(9;22)(q34;q11), в резултат на която се формира Ph*. Пациентите с Ph* имат най-лошата прогноза от всички видове B-ОЛЛ; но от друга страна – при тях успешно се прилага ТКИ (Imatinib), който подобрява степента на постигане на пълна ремисия.

Изследването обикновено се осъществява чрез установяване на молекулярните еквиваленти BCR-ABL mRNA посредством RT-PCR. За B-ОЛЛ оби­кновено е характерно наличието на протеин p190. При детекция на p210 формата, трябва да се обърне внимание за възможността за лимфобластна криза, възникваща при ХМЛ.

Въз основа на NGS се идентифицират т.нар. BCR-ABL1-like B-ОЛЛ, които се свързват с del на IKZF1, пренареждания в CRLF2 и неблагоприятна прогноза. При част от тези пациенти се намират мутации, които активират JAK1/2 гена, и при тях може да се приложи терапия с JAK2 инхибитор. При 25% от децата се среща t(12;21)(p12,q22), свързана с благоприятна прогноза и ОП >90%, като аберацията е рядка при възрастни. Уникалната характеристика на рядката t(5;14)(q31;q32) IL3/IGH при B-ОЛЛ, е асоциацията с еозинофилия поради свръхекспресията на интерлевкин 3. Исторически t(1;19) при B-ОЛЛ се е свързвала с лоша прогноза, но това се е променило чрез използването на интензивни химиотерапевтични режими. Имунофенотипно, бластите губят CD34, но имат аберантна експресия на CD9[2].

Остра Т-клетъчна лимфобластна левкемия
Молекулярната генетика на T-клетъчната ОЛЛ все още е по-слабо разбрана. Изглежда, че аномалии на гени като TAL1, LYL1 и HOX11 корелират със значими подтипове на заболяването и имат прогностично значение, но понастоящем са необходими допълнителни изследвания, за да се потвърдят тези резултати. Транслокациите в T-ОЛЛ обикновено включват един от локусите на TCR гена. Анализите за имуноглобулини и TCR пренарежданията рядко са от решаващо значение при поставянето на диагнозата, но се използват успешно за определяне на минималната резидуална болест при тези пациенти[11].

Диагностични и предиктивни биомаркери при зрялоклетъчни β-клетъчни лимфопролиферативни неоплазии
Зрялоклетъчните В-клетъчни лимфоидни неоплазии представляват хетерогенна група нарушения, клетъчният произход на които е от В-клетки, претърпели различна степен на диференциация и пренареждания в гените на имуноглобулиновите вериги. Различават се съществено както по клетъчните характеристики на малигнената популация, така и по тежест на протичане и отговор към терапия. В-клетъчните лимфоми съставляват над 85% от НХЛ[2]. Различни транслокации са свързани с B-клетъчните неходжкинови лимфоми (В-НХЛ) и тяхното установяване помага при диагнозата на тези нозолoгични категории.

Свръхекспресията на протеин BCL2 води до акумулация на неопластични клетки. В 85-90% от случаите на фоликуларен лимфом (ФЛ) и 25% от случаите на дифузен В-едроклетъчен лимфом (ДБЕЛ) се открива t(14;18)[2]. В практиката FISH анализът се предпочита пред PCR като доказано по-специфичен. При пациенти с ДБЕЛ, в допълнение към BCL2 в 10% от случаите се намират транслокации на BCL6 и MYC („double hit“ лимфом).
Лимфом на Burkitt (БЛ) е силно агресивен B-НХЛ и се характеризира с изключително висока степен на клетъчно делене на В-клетките. Характеризира се с t(8;14) с участието на MYC и IGH и по-рядко транслокации, включващи локуси на κ или λ. Транслокации в BCL6 може да се открият при ФЛ, ДБЕЛ и често се идентифицират при първичен кожен ДБЕЛ “тип крак”.

Почти всички случаи на мантелноклетъчен лимфом носят t(11;14)(q13;q32). CCND1-IGH, може да бъде оценена чрез FISH анализ, който е за предпочитане пред PCR базираните методи. Описани са и различни транслокации при лимфом, включващ мукозо-асоциирана лимфоидната тъкан. Най-характерни са транслокациите t(14;18)(q32;q21), t(11;18)(q21;q21), t(1;14)(p22;q32), които са свързани с резистентност към ерадикационната терапия за H. pylori.

BRAF V600E мутацията първонач­ално е открита при 100% от пациенти с трихолевкемия (ТЛ). Идентифицирането на мутацията като генетична причина за ТЛ даде нови възможности за експериментална терапия, особено при рецидивирали/рефрактерни пациенти, която се основава на инхибирането на BRAF с Vemurafenib, коинхибиция с неговият таргет MEK с Dabrafenib и Trametinib, както и комбинацията Vemurafenib + анти-CD20 моноклонално антитяло (Табл. 1)[12].

При лимфоплазмоцитния лимфом (ЛПЛ) в >90% е открита мутация в MYD88 гена, докато при маргинално зонови лимфоми, множествен миелом и хронична лимфоцитна левкемия (ХЛЛ), мутацията може да се установи при 3-9% от пациентите.

При ХЛЛ хипермутационният статус се оценява чрез сравняване на всеки един IGH клонално пренареден ген с последователности на V-региона на зародишната линия, за да се определи V-региона на гена, степента и позицията на соматичните мутации. Въпреки че при ХЛЛ са открити множество многобройни варианти с единичен нуклеотид, промени в броя на копията, понякога дори с документирана прогно­стична значимост като мутации в NOTCH1, определянето на тези мутации има ограничена роля в рутинната практика.

Зрялоклетъчни Т-клетъчни лимфопролиферативни неоплазии
Зрялоклетъчните Т-клетъчни лимфоидни неоплазии представляват хетерогенна група нарушения, които могат условно да бъдат категоризирани като лимфоми с предимно нодална, кожна или левкемична изява. Срещат се относително по-рядко и съставляват по-малко от 10-15% от НХЛ[2].

Най-общо 95% от Т клетките експресират α-β, а делът на γ-δ рецепторите е значително по-малък, които съдържат хетеродимерни протеини кодирани от TCR гени, разположени върху хромозоми 7 и 14. Southern blot анализът се счита за златен стандарт, но той е неефективен и рядко се използва за детекция на клоналност на Т-клетките в рутинната практика, в която са се наложили PCR-базираните подходи[13].

При ALK-позитивния анапластен едро­клетъчен лимфом t(2;5)(p23;q35) е най-честата генетична транслокация (83% при децата и 31% при възрастни). Описани са обаче различни по-рядко срещани партниращи гени, включващи TPM3 в 13% от пациентите, както и ATIC, TGS, CLTC, MSN, TPM4, MYH9 и ALO17, всички в <1% от пациентите[2]. Транслокацията може да бъде анализирана с помощ­та на RT-PCR или FISH[2,14].

В терапията успешно се прилага анти-CD30 моноклонално антитяло Brentuximab vedotin.

При Т-клетъчната пролимфоцитна левкемия, в 80% от случаите, най-често срещаната генетична аберация включва inv(14). В подгрупа от случаите присъства t(14;14). За анализа на двете аномалии се използва FISH. Цитогенетичният анализ служи за откриване на аномалии на хромозома 8 в 70-80% от случаите, del на АТМ, както и del (12p13)[2].

Хепатоспленалният Т-клетъчен лимфом се aсоциира с числени аномалии на хромозома 7. С напредването на болестта, се откриват 2 до 5 копия на i (7)(q10) или нарушения във втората хромозома 7. Детекцията на i (7)(q10) се прави с помощта на FISH[15].

При пациенти с Т-клетъчна левкемия при възрастни е характерна клонална интеграция на вирусната ДНК на човешкия Т-лимфотропен вирус тип 1(HTLV-1). Въпреки че е възможно тестване чрез секвениране по Sanger, обикновено е по-лесно да се направят серумни изследвания за HTLV-1[16].

Заключение
С широкото навлизане на молекулярния анализ в рутинната хематопатология и идентифицирането на нарастващ брой биомаркери, клиничната хематологична практика претърпя значителна промяна. Клиничното поведение и терапев­тичните решения, основани на новите прозрения за генетичната основа на злокачествените хематологични нарушения и по-доброто разбиране на основните механизми на хемопоезата и левкемолимфомагенезата, все повече се направляват от доказани диагностични и предиктивни маркери. Развитието на технологиите за тяхното установяване и мониториране, в това число секвенирането от ново поколение, променят клиничните парадигми и очертават ерата на персонализираната и прецизирана медицина. n

книгопис:
1. Biomarkers Definition Working Group. Biomarkers and surrogate endpoints: preferred definitions and conceptual framework. Clin Pharmacol Therapeutics 2001;69:89-95.
2. Swerdlow SH, Campo E, Pileri SA, Harris NL, Stein H, Siebert R, Advani R, Ghielmini M, Salles GA, Zelenetz AD, Jaffe ES. The 2016 revision of the World Health Organization classification of lymphoid neoplasms. Blood. 2016 May 19;127(20):2375-90.
3. O’Brien SG, Guilhot F, Larson RA, et al; IRIS Investigators. Imatinib compared with interferon and low-dose cytarabine for newly diagnosed chron¬ic-phase chronic myeloid leukemia. N Engl J Med. 2003;348(11):994-1004.
4. Grinfeld J, Nangalia J, Baxter EJ, et al.Classification and Personalized Prognosis in Myeloproliferative Neoplasms. N Engl J Med. 2018 Oct 11;379(15):1416-1430.
5. Langabeer SE, Andrikovics H, Asp J, et.al.; MPN&MPNr-EuroNet. Molecular diagnostics of myeloproliferative neoplasms. Eur J Haematol. 2015 Oct;95(4):270-9.
6. Xia D, Hasserjian RP. Molecular testing for JAK2, MPL, and CALR in myeloproliferative neoplasms. Am J Hematol. 2016 Dec;91(12):1277-1280.
7. Bond DR, Lee HJ, Enjeti AK. Unravelling the Epigenome of Myelodysplastic Syndrome: Diagnosis, Prognosis, and Response to Therapy. Cancers. 2020; 12(11):3128.
8. Veryaskina YA, Titov SE, Kovynev IB, Pospelova TI, Zhimulev IF. Prognostic Markers of Myelodysplastic Syndromes. Medicina. 2020; 56(8):376.
9. Döhner et al. Impact of NPM1/FLT3-ITD genotypes defined by the 2017 European LeukemiaNet in patients with acute myeloid leukemia. Blood 2020,135(5):371-380).
10. DiNardo. et al. How I treat acute myeloid leukemia in the era of new drugs. Blood 2020, 35(2):85-96.
11. John Kim Choi, 15- Precursor Lymphoid Neoplasms, Hematopathology (Third Edition), Elsevier, 2018, Pages 467-480.
12. Falini B, Tiacci E. New treatment options in hairy cell leukemia with focus on BRAF inhibitors. Hematol Oncol. 2019 Jun;37 Suppl 1:30-37.
13. Rådestad E, Wikell H, Engström M, et al. Alpha/beta T-cell depleted grafts as an immunological booster to treat graft failure after hematopoietic stem cell transplantation with HLA-matched related and unrelated donors. J Immunol Res. 2014;2014:578741.
14. Liang X, Meech SJ, Odom LF, et al. Assessment of t(2;5)(p23;q35) translocation and variants in pediatric ALK+ anaplastic large cell lymphoma. Am J Clin Pathol. 2004;121(4):496-506.
15. Mandava S, Sonar R, Ahmad F, et al. Cytogenetic and molecular characterization of a hepatosplenic T-cell lymphoma: report of a novel chromosomal aberration. Cancer Genet. 2011;204(2):103-107.
16. Tsukasaki K, Tsushima H, Yamamura M, et al. Integration patterns of HTLV-I provirus in relation to the clinical course of ATL: frequent clonal change at crisis from indolent disease. Blood. 1997.