Прескочи към главното съдържание на страницата

Архив


БРОЙ 1 2021

Терапия със стволови клетки в гастроентерологията и хепатологията

виж като PDF
Текст A
проф. д-р К. Кацаров
Клиника по гастроентерология и хепатология, Военно медицинска академия, София


Стволови клетки – видове, характеристики, свойства
Напредъкът в проучването на стволовите клетки (СК) през последните 15 г. засили интереса към потенциалните възможности за приложението им при лечение на заболявания на ГИТ и ХБС. Теоритичната концепция за приложението им се базира на предположението, че СК биха възстановили тъканната цялост и функция при заболявания на тези органи и системи. Въпреки че на теория тъканната регенерация би трябвало да се осъществява от тъканно ограничените зрели СК (ЗСК), поради трудната им идентификация и изолация вниманието на изследователите беше насочено към ембрионалните СК и подобните им, т.нар. индуцирани плурипотентни СК. ЕСК са плурипотентни клетки, произлизащи от вътрешната клетъчна част на преимплантационния ембрион, които могат да се самоподдържат и да се диференцират във всички клетъчни типове iv vivo и in vitro. Изучаването на ЕСК разкри няколко възможни направления пред клетъчната терапия.

Генна терапия – коригиране на генетични аномалии в ЕСК преди терапевтична имплантация. Докато ЗСК имат лимитиран пролиферативен капацитет ЕСК, третирани със съответните клетъчни фактори, могат да пролиферират практически безкрайно в клетъчни култури и да поддържат възможността да се диференцират във всички тъкани на развиващия се организъм. Специфичните за даден пациент ЕСК също могат да се получат чрез трансфер на ядрото в енуклеиран ооцит, т.е. клонира се ембрион (случаят с овцата Доли)[3].

Въпреки обещаващите резултати от комбинацията на нуклеарно клониране, генна и клетъчна терапия за лечение на генетични заболявания при животински модели, се счита, че тази стратегия е малко вероятно да „сработи“ при хора. Една от причините е, че въпреки задоволителния успех постигнат при диференцирането на ЕСК в екто- и мезодермални тъкани, диференцирането в ендодермалните (т.е. и в тъканите на ГИС) е с незадоволителни за сега резултати. Проблемни за развитието на проучванията, свързани с приложението на ЕСК, са и възникналите законодателни, етични и религиозни въпроси. Друго обещаващо направление в генната и клетъчна терапии е използването на индуцирани плурипотентни СК (ИПСК). Те са продукт от препрограмирането на соматични клетки и довеждането им до състояние подобно на ЕСК. Методът е публикуван за първи път от Yamanaka et all.

Използвани са миши фибробласти, които посредством ретровирус-медиирана интродукция на четири гена, кодиращи човешки транскрипционни фактори се трансформират в плурипотентни клетки. Въпреки че се счита, че ИПСК са идентични с ЕСК, рисковете свързани с индуцирането на някои транскрипционни фактори (онкопротеините c-MYC и KLF4), както и ретровирусните вектори, лимитират използването на ИПСК в клиничните проучвания на този етап. Въпреки това ИПСК технологията се разглежда като перспективен метод за генериране на СК, дори и заради липсата на етичните и технически проблеми свързани с генерирането на ЕСК[4,5]. Редица публикации след 2007 г. разглеждат възможностите за лечение на IBD и заболявания, водещи до чернодробна недостатъчност чрез повлияване на имунните патогенетични механизми посредством прилагане на мезенхимални СК (МСК).

Те са извлечени от костния мозък СК, експресират в различна степен специфични тъканни маркери (CD105, CD73, CD44, THY1, TfR1, CD71, CD271), разпознават се от моноклоналното тяло STRO-1 и не експресират хематопоетични маркери. МСК се диференцират в мезодермални тъкани, като кости, хрущяли, гладки мускули и мастни тъкани. Съществува и една уникална подгрупа МСК, произхождаща от мезенхималния компартимент на костния мозък – мултипотентните зрели прогениторни клетки (МЗПК). Счита се, че МЗПК могат да се диференцират в няколко ендодермални или невроектодермални клетъчни линии, включващи стомашни епителни клетки, хепатоцити, пневмоцити, астроцити, пигментни епителни клетки.

Проучванията сочат, че МСК играят роля както в тъканната регенерация и заздравяването на раните, така и в „захващането“ на графта и намаляване тежестта на graft-vs-host феномена при трансплантации на тъкани и органи. Установено е, че друга специфична подгрупа МСК намалява прогресията на ранната стомашна канцерогенеза при мишки и би могла да се използва при лечението и профилактиката на стомашните преканцерози[6].

С други думи, и двата варианта – in vivo стимулацията на тъканните зрели СК (ТЗСК), както и ex vivo култивираните и диференцирани от тях прогениторни клетъчни култури, стоят в основата на клетъчната терапия при заболявания на ГИТ и ХБС. За сега най-добре проучени са хемопоетичните и СК в централната и периферна нервна система. Съществуването и изолирането на тъканно ограничени СК в панкреаса, черния дроб и в ГИТ и до сега са обект на дебати в научната общност. Изключение са интестиналните СК. Тяхното изолиране и проучване доведе до значим прогрес в концепциите за регенеративна терапия на заболяванията на червата. Морфологичната идентификация на ТЗСК от останалите клетки чрез стандартните тъканни маркери е трудна.

Счита се, че ТЗСК са разполижени в т.нар. тъканни „ниши“ – зони с оптимална среда за нормална диференциация, като в повечето случаи броят на СК в тези ниши е малък. Предполага се, че в тези ниши СК остават в „латентно“ състояние или се делят с много ниска честота, поради което са негативни за повечето пролиферативни маркери (Ki67, PCNA, BrdU). Тези маркери ще се позитивират при прогениторните клетки (ПГК), производни от СК и намиращи се в непосредствена близост до тях.

Счита се, че ТЗСК обикновено се делят асиметрично, като дават начало на самоподдържаща се линия от идентични клетки и втора, прогениторна линия клетки. Поддържането на СК в „латентно“ състояние, теоритично поддържа ниско ниво на мутации и се явява част от антитуморната защита. ПГК имат кратък живот, образуват бързоделящи се клетъчни колонии и периодично се репродуцират от СК. Предполага се, че нарушената микросреда в клетъчните „ниши“ в резултат на различни фактори (хронично възпаление), е в основата на трансформацията на СК/ПГК в карциномни СК. В резюме, повечето автори приемат, че съществуват два типа СК – „латентни“ и бързоделящи се, като поведението на двете групи се определя от микросредата (нишата), в която се намират[7,8].

Стволовите клетки имат и така наречената от много автори „тъмна страна“. Тя е следствие от теорията, че канцерогенезата при възрастните е свързана с тъканните СК. Т.е. злокачествените заболявания биха могли да се разглеждат като резултат от трансформация на СК в канцерогенни СК, отговорни за пролиферацията и метастазирането на заболяването.

И двете групи нормални и канцерогенни СК дават начало на фенотипно хетерогенни клетки с различна степен на диференциация. Развитието на туморния процес от канцерогенните СК, характеризиращ се като абнормен и лошо регулиран процес на органогенеза „копира“ този при нормалните СК. Две групи маркери са показателни при идентификацията на карциномните СК – CD44 и prominin-1. Предполага се, че в резултат на различни въздействия, водещи до формиране на хронични възпалителни процеси, СК могат бавно да развият генетични промени, водещи до загуба на контрол върху растежа, пролиферацията и апоптозата, с последваща трансформация в карциномни СК. Другата клетъчна група с потенциал за прекусор на карциномните СК са костно-мозъчните дендритни клетки (КМДК). Въп­реки че нямат плурипотентния потенциал на ЕСК, те са по-пластични по отношение на диференциацията от повечето зрели СК и могат да мигрират към периферните органи при процеси свързани с възпаление или други тъканни нарушения.

Счита се, че заедно с костно-мозъчните ендотелиални прогениторни клетки стимулират ангиогенезата при туморното формиране[9,10].
Проучванията, свързани с прилагането на стволовите клетки за медицински цели предизвикват освен научни и значими политически и морални дебати в обществото. Често мненията са поляризирани и варират от обществена и правителствена поддръжка (Великобритания, Китай, Южна Корея, Япония, Израел и Сингапур) до различни по степен рестрикционни модели, колебаещи се от разрешаване само на научни проучвания (Нидерландия и Германия) до пълната им забрана (Австрия).

Роля на стволовите клетки в регераторните процеси на ГИТ
Известно е, че епителните тъкани на черния дроб и ГИТ имат голям регенераторен потенциал и бърз клетъчен оборот. При тънкочревните тъкани клетъчният оборот се осъществява на всеки 2-7 дни в нормално състояние, а в случаите на тъканни увреди и по-бързо. Тази бърза регенерация се осъществява в резултат на постоянната пролиферация на ПГК, локализирани в криптите. За разлика от СК в повечето тъкани при бозайниците, СК на червата са топично локализирани в епителните крипти. Две са основните хипотези за локализацията и идентифицирането на тънкочревните СК. Първата е т.нар. „+4 позиционен модел“, според който СК се намират на позиция 4, броено от дъното на криптата, директно над Paneth клетките. От тази позиция те могат да се движат нагоре и да се диференцират в Goblet клетки, ентероцити и ентероендокринни клетки. Ако мигрират надолу, се трансформират в Paneth клетки. Втората и по-нова хипотеза се базира на идентификацията на в криптите на „base columnar cells“ (ВСС), разположени между Paneth клетките. Установено е, че ВСС клетките експресират специфичен маркер – Lgr5. Експериментално е доказано, че клетките, експресиращи този маркер, имат дълъг живот и могат да се диференцират във всички видове епителни клетки. Тезата, че СВС Lgr5+ клетки са автентични интестинални СК се потвърждава и от проучвания върху епитела на колона. На базата на тези студии се приема, че Lgr5 е сигурен маркер за доказване на СК, разположени в чревните крипти. Редица нови проучвания сочат, че МСК, произхождащи от костния мозък (КМ) също играят роля в процесите на интестинална регенерация и фиброза. Прилагането на КМ екстрахирани СК на експериментални животински модели и при хора показват, че те могат да репродуцират клетки, показващи характеристики на четирите линии интестинални епителни клетки. В допълнение КМ екстрахираните СК могат да се диференцират във всички клетъчни типове, необходими за неоангиогенезата – перицити, ендотелни и гладкомускулни клетки, като по този начин участват във всички етапи на тъканната регенерация[11,12].


Терапия със стволови клетки при пациенти с интестинални заболявания
Счита се, че тезата за появата и развитието на възпалителните заболявания на червата на базата на нарушена имунна регулация при генетично предразположени индивиди е общоприета. Въпреки напредъка в терапията на тези заболявания – влизане на нови терапевтични линии (биологична терапия) и оптимизиране на „старите“ имуносупресивни и противовъзпалителни режими, при значителна част от пациентите не се достига до клинична ремисия, като качеството на живот е силно нарушено. Първоначалните съобщения за ремисия на IBD и цьолиакия идват като „страничен ефект“ при лечение на пациенти със съпътстващи малигнени хемопатии, при които е приложена хематопоетична СК трансплантация. Предполага се, че ремисия се постига по два начина – чрез промяна на генетичната предиспозиция към IBD и в резултат на интензивната имуносупресия, която потиска или изчиства патологичния лимфоцитен клон, поддържащ възпалителния процес. На тази база са проведени две изследвания фаза I, в която участват 16 пациенти с рефрактерна на лечение болест на Crohn с приложена хемопоетична СК трансплантация. Ремисия е постигната при 14/16 пациенти, но са отчетени значими странични ефекти[13]. Подобно проучване е проведено и при пациенти с цьолиакия тип II, с участието на 7 пациенти. Ремисия е постигната при 6/7 пациенти след среден период на проследяване 15.5 месеца[14]. До момента са регистрирани над 100 клинични проучвания за ефективността на МСК при имуномедиирани заболявания, кардиоваскуларни и ортопедични заболявания и органна трансплантация. МСК са прилагани като единична инфузия в отворено фаза II клинично проучване при 10 пациенти. При всички е отчетено сигнификантно намаление на CDAI индекса срeдно със 105 точки на 28 ден. Съобщава се за позитивна корелация между дозата на вливане и позитивния резултат[15]. Друго проучване анализира ефекта от двукратно приложение на инфузия на МСК при пациент с остро настъпил, тежък GvHD с ангажиране на ГИТ и рефракторно на стандартното лечение протичане. Отчетена е 53% преживяемост на втората година след лечението[16]. В заключение може да се каже, че имуномодулиращият и имуносупресивен ефект, възможността за диференциране в тъканно-специфични клетки, стимулирането и участието в неоангиогенезата, ниската имуногенност (позволяваща прилагането без съпътстваща имуносупресия) и сравнително лесната процедура по изолирането, правят използването на МСК в основно направление за развитие на клетъчните терапии.
Терапия със стволови клетки при пациенти с чернодробни заболявания
Черният дроб е орган с висок регенераторен капацитет. Състои се от хепатоцити и билиарни епителни клетки (БЕК), които се диференцират от общи прогениторни клетки – хепатобласти. В зависимост от източника, съществуват два модела на чернодробна регенерация – хепатоцитна и чернодробно прогениторно клетъчно (ЧПК) зависима. Пример за хепатоцитна регенерация са големите резекции или ситуациите с жив донор, при които се отстранява до 2/3 от хепатоцитната маса. В рамките на няколко месеца, следствие на хепатоцитната пролиферация, се възстановява чернодробният обем. В други случаи, в резултат на токсични или вирусни въздействия, се стига до блокиране на хепатоцитната регенерация и се задейства вторият регенераторен път. При него БЕК (билиарни епителни клетки) се дедиференцират до ЧПК, наричани още овални клетки. На следващия етап те се диференцират в хепатоцити. Получава се затворен цикъл, тъй като освен дедиференциацията БЕК–ЧПК, подобен процес може да се наблюдава от хепатоцитите към ЧПК и след това обратно към хепатоцитите. Прието е, че ЧПК (наричани още чернодробни СК) произлизат от БЕК поради тяхното фенотипно сходство и локация. Счита се, че ЧПК базираната регенерация е по-значима при тежки клетъчни увреждания на черния дроб, поради което се разглежда като преспективно направление в клетъчната терапия при подобни пациенти. ЧПК са описани най-напред при плъхове и са наречени овални клетки поради овалната форма на ядрото. Анатомично са разположени в каналите на Hering – интрахепатални жлъчни дуктули, разположени между жлъчните канали и хепатоцитите. Счита се, че ЧПК не се наблюдават в нормалния черен дроб и се появяват в отговор на остро или хронично чернодробно увреждане. Те експресират както чернодробни (KRT18, KRT7, albumin), така и БЕК (SOX9, KRT19,EpCAM и KRT7) маркери, а в някои случаи и AFP. Резултатите от някои проучвания сочат, че МСК могат да се диференцират до ЧПК, като се явяват възможна опция за лечение на хепатоцитните поражения.
Засега единствената работеща възможност за лечение на тежките форми и крайните стадии на хроничните чернодробни заболявания е чернодробната трансплантация. Като алтернативна възможност през последните близо четири десетилетия се разработваше хепатоцитната трансплантация или използването на хепатоцити в биоартифициални депурационни системи. Поради затрудненията, свързани с извличането на хепатоцитите, поддържане на тяхната виталност и функционалност, тези методи не можаха да се наложат в клиничната практика. В този смисъл приложението на СК в комбинация с растежни фактори, се счита за обещаващ метод за подпомагане на чернодробната регенерация. Потенциалната терапевтична полза от приложението на КМ изолирани МСК е изследвана за първи път след тяхното изолиране, като интрапортална инфузия с клонова портална емболизация при пациенти с хепатобластом и последваща високо обемна чернодробна резекция. При всички пациенти[9] е наблюдавано значимо подобрение на Child-Pugh скор и албуминовите нива[17,18]. Друг клиничен подход комбинира ефектите от приложението на G-CSF (гранулоцит стимулиращ фактор), левкоцитна афереза и реинфузия на ЧПК. Съобщава се за значимо подобрение на биохимичните показатели и хистологичната картина при двама пациенти с хронична и един с остра чернодробна недостатъчност[19]. При друго проучване, с пет пациенти с остра върху хронична чернодробна недостатъчност (фаза I), приложението на комбинацията G-CSF и инфузията на МСК подобряват чернодробната функция в над половината от случаите, за период от 60 дни, като положителният ефект според авторите продължава около 12 месеца[20]. Ефектът от реинфузия на CD34+ ЧСК (получени след приложение на G-CSF) при девет пациенти с чернoдробна цироза, е оценен като добър по отношение на показателите и толерирането на инфузията. При друго проучване 40 рандомизирани пациенти с HBV цироза са били разделени на две групи – получили G-CSF самостоятелно или в комбинация с моноцити, изолирани от периферна кръв (апликациите са в хепаталната артерия). През 6-месечния период на наблюдение и в двете групи е отчетено значимо биохимично и клинично подобрение[21]. Друго проучване прилага прясно изолирани автоложни стволови клетки (от мастна тъкан) при пациенти в краен стадий на чернодробна цироза. През едномесечния период на проследяване е отчетено значимо подобрение на клиничните показатели и не са отчетени значими странични ефекти[22]. Проучва се и приложението на СК при трансплантирани пациенти и повлияването на острата реакция на отхвърляне. Приложени са МСК (изолирани от пъпна връв), като е отчетено овладяване на процеса на отхвърляне и значимо подобрение на хистологичната находка[23]. По-голямата част от цитираните проучвания страдат от редица методологични недостатъци – малки групи, липса на рандомизация и контрол. Очевидна е необходимостта от големи рандомизирани проучвания в това направление, като основната спънка са локални законови и морално-етични и религиозни норми. Изглежда, че основното направление за приложение на СК в хепатологията ще бъде на bridging процедури при пациенти в листата за чернодробна трансплантация или поддържане и подобряване на чернодробните функции при пациенти, които по някаква причина не са показани за трансплантация.
Заключение
Терапията със стволови клетки очевидно ще бъде едно от основните направление в областта на регенеративната медицина. Тя се явява обещаващ метод на лечение при пациентите с краен стадий на черно­дробни заболявания и резистентни на терапия възпалителни заболявания на червата. n




книгопис:
1. Keller G. Embryonic stem cells differentiation: emergence of a new era in biology and medicine. Genes Dev 2009;19:1129-1155.
2. Chuong CM et al. The river of stem cells. Cell Stem Cell 2009;4:100-102.
3. Stappenbeck TS et al. The role of stromal stem cells in tissue regeneration and wound repair. Science 2009; 324:1666-1669.
4. Hochedlinger K et al. Nuclear Transplantation, embryonic stem cells, and the potential for cell therapy. N Engl Med 2003:349:275-286
5. Nishikawa S et al. Tne promise of human induced pluripotent stem cells for research and therapy. Nat Rev Mol Cell Biol 2008;9:725-729.
6. Uccelli A et al. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat Rev Immunol 2008;8:726-736.
7. Fellous TG et al. A methodological approach to tracing cell lineage in human epithelial tissues. Stem Cells 2009;27:1410-1420.
8. Scoville DH et al. Current view: intestinal stem cells ang signaling. Gastroenterology 2008;134:849-864.
9. Rosen JM et al. The increasing complexity of the cancer stem cells paradigm. Science 2009;324:1670-1673.
10. Shackleton M et al. Heterogeneity in cancer: cancer stem cells versus clonal evolution. Cell 2009;138:822-829.
11. Clevers H. Searching for adultstem cells in intestine. EMBO Mol Med 2009;1:255-259.
12. Sato T et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature 2011:469:415-418.Gastroenterology 2005;128:552-563.
13. Oyama Y et al. Autologus hematopoetic stem cell transplantation in patients with refractory Crohn’s disease. Gastroenterology 2005;128:552-563.
14. Al-toma A et al. Autologus hematopoetic stem cell transplantation in refractory celiac diease with aberrant T cells. Blood 2007;109:2243-2249.
15. Tauoirin P. OTI-010 Osiris Therapeutics/JCR Pharmaceuticals. Curr Opin Investig Drugs 2006;7:473-481.
16. Le Blanc K et al. Mesenchymal stem cells for treatment of steroid-resistent, severe, acute graf-versus-host disease: a phase II study. Lancet 2008;371:1579-1586.
17. Am Esch JS et al. Portal application of autologous CD133+ bone marrow cells to the liver: a novel concept to support hepatic regeneration. Stem Cells 2005 ;23:463-470.
18. Terai S et al. Improved liver function in patients with liver cirrhosis after autologous bone marrow cell infusion therapy. Stem Cells 2006;24:2292-2298.
19. Yannaki E et al. Lasting amelioration in the clinical course of decompensated alcoholic cirrhosis with boost infusions of mobilized peripheral blood stem cells. Exp Hematol 2006;34:1583-1587.
20. Gordon MY et al. Characterization end clinical application of human CD34+ stem/progenitor cell populations mobilized into the blood by granulocyte colony-stimulating factor. Stem Cells 2006;24:1822-1830.
21. Han Y et al. Controlled trials in hepatitis B virus-related decompensate liver cirrhosis: peripheral blood monocyte transplant versus granulocyte-colony-stimulating factor mobilization therapy. Cytotherapy 2008;10:390-396.
22. Sakai Y et al. Phase I clinical study of liver regenerative therapy for cirrhosis by intrahepatic arterial infusion of freshly isolated autologous adipose tissue-derived stromal/stem (regenerative) cell. Regen Ther 2017;6:52-64.
23. Shi M et al. A pilot study of mesenchymal stem cell therapy for acute liver allographt resection. Stem Cells Transl Med 2017;6:2053-2063.